その場でパラフィン埋め込まれた大人サンゴの標本の交配の技術
Summary
このプロトコルの目標はパラフィンに埋め込まれているされていると、スライド ガラス上に断面採取したサンゴ大人上の in situハイブリダイゼーションを行うことです。これはパラフィン包埋組織の RNA アンチセンス プローブの空間表現を視覚化するために使用する質的研究法です。
Abstract
サンゴは海の全体的な健康だけでなく、人間の健康に欠かせない重要な海洋無脊椎動物です。海水の温度上昇や海洋酸性化など人間活動の影響、ためサンゴが、ますます脅威にさらされています。これらの課題に取り組む、細胞および分子生物学の進歩は、サンゴの健康を診断するために重要であると証明しています。人間の薬でよく使用される技術のいくつかを変更すると、サンゴを付けて治療する研究者の能力が大幅に向上。これに対処するため人間の医学と進化発生生物学で主に使用されるその場で交配のためのプロトコルは、ストレスの下で大人のサンゴで使用に適応されています。
このメソッドの目的は、パラフィンに埋め込まれているされており、スライド ガラス上に断面を有する成人のサンゴ組織における RNA プローブの空間表現を視覚化することです。このメソッドは、サンプルの退避とパラフィンの除去、サンプル、前ハイブリダイゼーション インキュベーション、RNA プローブの可視化と RNA のプローブの交配の透過性を確保するためのサンプルの前処理について説明します。これは、場所特定の遺伝子の表現し、プロトコルは他の非モデル生物のために容易に適応することができますを発見する非モデル生物を用いた強力な方法です。ただし、メソッドは限られた表現強度可視化ステップとプローブの濃度の間に使用されている時間の量によって異なるため、それが主に質的です。さらに、忍耐が必要、このプロトコルは、最大 5 日 (および多くの場合より長い) によって使用されているプローブを取ることができます。最後に、非特異染色が一般的でが、この制限を克服することができます。
Introduction
サンゴが重要な生態系のビルダーと海洋と人間の健康1,2,3における生物多様性のために重要です。彼らの気候変動とその他の人為的ストレスの脅威の下で、多くのサンゴ種が絶滅危惧と見なされます。したがって、ストレス下でのサンゴを診断する細胞・分子ツールの重要な必要性があります。また、そこは少しについて理解される大人のサンゴの組織とほとんど理解したがってこれらの遺伝子の機能の内にある遺伝子。この問題を解決するには、我々 はその場で交配 (っぽい)、一般的に使用するプロトコル人間の医学と進化発生生物学、大人のサンゴのパラフィン埋め込まれた組織サンプルでの使用のために適応しています。この手法は、最も強力な熱ストレスへの暴露などのストレスの多いイベントを受けている大人のサンゴで使用した場合です。ただし、この手法は組織やサンゴのライフ ステージの広い範囲で使用することができ、だけ熱重点を置かれたサンゴ4,6,7に制限されていません。また、cDNA シーケンス情報がある限り、この方法を組織または任意の後生動物の細胞に使用できます。
このメソッドの目的と保存にし、パラフィンに埋め込まれたスライド上に断面大人のサンゴの組織内 RNA プローブを視覚化することです。このメソッドは、大人のサンゴの組織内にある核酸を可視化できる強力な診断ツールです。最初このメソッドは、医療診断のため開発された、発生生物学、進化発生生物学8,9,10等の分野で人気のツールとなっています。ISH はまた非モデル システム、ゲノムで特に重要なメソッドとトランスクリプトーム シーケンス データがありますが、空間の遺伝子発現パターンが知られています。それは興味の遺伝子を表現する細胞や組織と詳細ターゲットを絞った治療アプローチ8,9,10につながることができますを示すことができるための非モデル系診断仕事のためこの手法は強力です 11,12。最後に、この手法は定性的および定量的遺伝子発現データ11と組み合わせればより強力です。
ジゴキシゲニン (DIG) を設計しているすでに研究者の関心のこのペーパーで説明するアプローチになります-標識 RNA プローブ (センスとアンチセンス プローブ) とは今その場でサンプルをプローブの交配を実行する準備ができています。このメソッドを実行するには、対象の各プローブ パラフィンティッシュ サンゴの 2 つの連続切片を必要となります。1 つのセクションは、意味プローブとアンチセンス プローブ使用されます。センス プローブは、非特異的結合を示すコントロールになります。染色センス プローブで観察される場合、は、アンチセンス プローブは興味の RNA に固有ではありません。プローブは、任意の遺伝子の表現を設計できます。このプロトコルでは熱ストレス下のサンゴの中に表現される検出された以前のいくつかの例が使用される: FBJ マウス骨肉腫ウイルス遺伝子相同物 B (Fos B)、活性化タンパク質 (AP1) と腫瘍壊死因子受容体 41 (TNFR 41)11。DIG 標識 RNA プローブを用いた ISH は取り扱いが多くのより安全な10 のため放射性プローブの使用より優先されます。さらに、この手法は、機密性が高いと組織と熱ストレス アダルト サンゴ13,14,15,16を超えて胚の広い範囲で実行することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルで説明する方法は、医学と進化的発達研究8,9,10,12,17で前作から変更されています。このプロトコルは、保持されているし、パラフィンに埋め込まれた大人のサンゴに DIG 標識 RNA アンチセンス プローブの in situハイブリダイゼーションのニュアンス?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品賞によって資金が供給されたないです。バローズ Wellcome 基金ポスドク濃縮プログラムから国立科学財団海洋科学員と賞の no.1012629 を介して OCE 1323652。
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
Referências
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