На месте Методы гибридизации парафин врезанных взрослых коралловые образцов
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в выполнить в situ гибридизация на взрослых коралловые образцы, которые заливали в парафин и секционного на стеклянных вставках. Это качественный метод, используемый для визуализации пространственное выражение смысл борьбы с зонд РНК в парафин врезанных тканей.
Abstract
Кораллы являются важные Морские беспозвоночные, которые имеют решающее значение для общего здоровья океана, а также здоровья человека. Однако из-за воздействия человека, таких, как повышение температуры океана и окисление океана, кораллы все чаще оказываются под угрозой. Для решения этих проблем, прогресс в клеточной и молекулярной биологии доказали исключительно важное значение для диагностики здоровья кораллов. Изменив некоторые из методов, обычно используемых в человеческой медицине может значительно улучшить исследователей возможности лечения и сохранения кораллов. Для решения этой проблемы, протокол в situ гибридизация используется главным образом в человеческой медицине и эволюционной биологии развития был адаптирован для использования в взрослых кораллы стрессу.
Этот метод предназначен для визуализации пространственное выражение РНК зонда в взрослых коралловые ткани, заливали в парафин и секционного на стеклянных вставках. Этот метод фокусируется на удаление парафина и регидратации образца, подготовка образца для обеспечения проницаемость образца, предварительно гибридизации инкубации, гибридизация зонда РНК и визуализация РНК зонда. Это мощный метод при использовании не модельные организмы обнаружить конкретные гены выражены, где протокол может быть легко адаптирована для других организмов-модель. Однако метод является ограниченным в том, что это прежде всего качественные, потому что выражения интенсивности может варьироваться в зависимости от количества времени, во время этапа визуализации и концентрация зонда. Кроме того требуется терпение, как этот протокол может занять до 5 дней (и во многих случаях дольше) в зависимости от используемого зонда. Наконец фон неспецифичный пятнать является общим, но это ограничение можно преодолеть.
Introduction
Кораллы являются строители критических экосистем и важное значение для биоразнообразия в океане и здоровья человека1,2,3. Они находятся под угрозой из-за изменения климата и других антропогенных факторов стресса, и многих видов кораллов, считаются в критическом состоянии. Таким образом существует значительная потребность в клеточном и молекулярном инструменты для диагностики кораллов в состоянии стресса. Кроме того существует мало понято о где гены выражены в взрослых коралловые ткани и поэтому мало понимания функции этих генов. Для решения этой проблемы, мы адаптировали в situ гибридизация (ISH) протокол, широко используется в медицине и эволюционной биологии развития, для использования на образцах парафин врезанных тканей взрослого кораллов. Этот метод является наиболее мощным средством, когда используются на взрослых кораллов, которые пережили стрессовые события, например воздействия теплового стресса. Однако этот метод может быть использован на широкий спектр тканей и этапов жизни в кораллов и не ограничивается только тепло подчеркнул кораллы4,6,7. Кроме того этот метод может использоваться на ткани или клетки любого многоклеточные, пока существует cDNA последовательности информации.
Этот метод предназначен для визуализации РНК зондов в взрослых коралловые ткани, которая была сохранена и заливали в парафин и секционного на слайды. Этот метод является мощный диагностический инструмент, который позволяет для визуализации нуклеиновых кислот в взрослых коралловые ткани. Первоначально этот метод был разработан для медицинской диагностики, и с тех пор она стала популярным инструментом в таких областях, как биология развития и эволюционной биологии развития8,9,10. ISH также критического метода, особенно в системах-модель, когда геномных и транскриптомики последовательность данных доступны но картин выражения гена пространственных неизвестны. Для диагностики работы в системах-модели этот метод является мощным, поскольку он может указать, какие клетки и ткани Экспресс ген интереса и может привести к более целенаправленной терапевтические подходы8,9,10, 11,12. Наконец этот метод качественных и более мощным, когда в паре с количественный ген выражение данных11.
Подход, изложенный в настоящем документе будет представлять интерес для исследователей, которые уже разработали digoxigenin (DIG)-помечены РНК зонд (смысл и antisense зонды) и являются теперь готовы выполнить в situ Гибридизация зондов для образца. Для выполнения этого метода, два последовательных секций коралловые парафин ткани будет необходимо для каждого зонда тестируется. Одна секция будет использоваться для чувство зонд и другой для антисмысловых зонд. Зонд смысле будет элемент управления для указания привязки неспецифические. Если окрашивание наблюдается в смысле зонд, антисмысловых зонд не специфичные для РНК интерес. Датчики могут быть разработаны для любого гена выразил. В настоящем Протоколе, которые были ранее признаны будут выражены в ходе тепловой стресс в кораллы используются несколько примеров: FBJ мышиных остеосаркома вирусного онкогена гомолога (Fos-Б), протеин активатор (ДП-1) и фактор некроза опухоли рецепторов 41 (TNFR 41)11. ИШ, с использованием зондов DIG-меченых РНК является предпочтительным по сравнению с использованием радиоактивных зонды, потому что их обработка гораздо безопаснее10. Кроме того этот метод очень чувствительна и может быть выполнена на широкий спектр тканей и эмбрионов за тепло подчеркнул взрослых кораллы13,14,,1516.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный в настоящем протоколе был изменен с предыдущей работы в медицинских и эволюционного развития исследований8,9,10,12,17. Этот протокол посвящен нюансы в situ гибридизация с DIG-меченых …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась премии нет. ВВЦ-1323652 через no.1012629 национальной науки фонд океана науки докторской стипендии и премии от Берроуз Уэллком фонда докторской программы обогащения.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
Referências
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
