Artikkelen beskriver en optimalisert protokoll for å gjøre levedyktig hjernen-hypofysen vev skiver, bruke teleost fisk medaka (Oryzias latipes), etterfulgt av elektrofysiologiske opptak av hypofysen celler ved hjelp av patch-klemme teknikken med den perforert oppdateringen konfigurasjon.
Elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler har vært gjennomført i mange virveldyr arter, men svært få i teleost fisk. Blant disse er et klart flertall utført på avstand primære celler. Forbedre vår forståelse av hvordan teleost hypofysen celler, oppfører seg i et mer biologisk relevante miljø, viser denne protokollen hvordan å forberede levedyktig hjernen-hypofysen skiver med liten fisk medaka (Oryzias latipes). Gjør hjernen-hypofysen skiver, ble pH og osmolality av alle løsninger justert til verdiene i kroppsvæsker hos fisk som lever på 25 og 28 ° C. Etter sektor forberedelse demonstrerer protokollen hvordan å gjennomføre elektrofysiologiske opptak med perforert hele celle patch-klemme teknikk. Patch-klemme teknikken er et kraftig verktøy med enestående timelige oppløsning og følsomhet, tillater undersøkelse av elektriske egenskaper fra intakt hele celler ned enkelt ionekanaler. Perforert oppdateringen er unik ved at den holder intracellulær miljøet intakt hindrer regulatoriske elementer i stoffer i å bli utvannet av oppdateringen pipette elektrode løsningen. I kontrast, når du utfører tradisjonell hele celle innspillinger, ble det observert at medaka hypofysen cellene raskt mister evnen til å skyte action potensialer. Blant de ulike perforering teknikkene tilgjengelig demonstrerer denne protokollen hvordan å oppnå perforering av lappet membranen bruker soppdreper amfotericin B.
Hypofysen er en nøkkel endokrine organ i virveldyr ligger under hypothalamus og bakenfor optikk chiasm. Det produserer og skiller ut seks til åtte hormoner fra de spesifikke celletyper. Hypofysen hormoner utgjør et mellomledd mellom hjernen og eksterne organer og kjøre en rekke viktige fysiologiske prosesser, inkludert vekst og reproduksjon regulering av homeostase. Lik neurons, endokrine cellene i hypofysen er elektrisk nervøs muligheten til å skyte action potensialer spontant 1. Rollen som disse action potensialene er celle avhengige. I flere celletyper pattedyr hypofysen, kan action potensialer heve den intracellulær Ca2 + tilstrekkelig for en vedvarende release av hormon 2. I tillegg mottar hypofysen både stimulerende og hemmende informasjon fra hjernen som påvirker membran potensialet i celler 3,4,5,6. Vanligvis stimulerende input øker excitability og ofte innebærer utgivelsen av Ca2 + fra intracellulær butikker samt økt avfyring frekvens 7. Forstå hvordan cellen benytter ion kanal sammensetningen og tilpasser seg disse inngangssignaler fra hjernen er nøkkelen til forståelse hormon syntese og slipp.
Patch-klemme teknikken ble utviklet i 1970 av Sakmann og Neher 8,9,10 og ytterligere forbedret av Hamill 11, og gir detaljerte undersøkelser av elektrofysiologiske egenskaper av celler ned enkelt ionekanaler. Videre er kan teknikken brukes for å studere både strøm og spenning. I dag, er patch-klemanordning gull standard for måling av elektrofysiologiske egenskaper av cellen. Fire store konfigurasjoner av tett patch-klemme teknikken har vært utviklet 11; celle-vedlagt, innsiden ut, på utsiden ut og hele celle oppdateringen. De tre første konfigurasjonene brukes vanligvis for enkelt ion kanal undersøkelser. For det fjerde, etter celle tilknyttet konfigurasjonen, er hull i cellemembranen fremstilt med sub atmosfærisk trykk. Denne konfigurasjonen tillater også undersøkelser av ion kanal sammensetningen av hele cellen 12. Imidlertid er en begrensning av denne teknikken at cytoplasmatiske molekyler er utvannet av oppdateringen pipette løsning 13 (figur 1A), noe som påvirker de elektriske og fysiologiske responser av studerte celler. Faktisk kan noen av disse molekyler spille viktige roller i Albin på signalet eller regulering av ulike ionekanaler. For å unngå dette, utviklet Lindau og Fernandez 14 en metode der en pore-forming sammensatt legges til oppdateringen pipette. Etter celle tilknyttet konfigurasjonen, sammensatte vil innlemme i plasma membranen under oppdateringen og sakte autoperforering membranen lage elektrisk kontakt med stoffer (figur 1B). Du kan bruke flere ulike antifungals som nystatin 15 og amfotericin B 16eller tensider som saponin beta-escin 17,18 . Disse forbindelser opprette porene stor nok monovalent kasjon og Cl– spredning mellom stoffer og patch pipette samtidig bevare cytosolic nivåene av makromolekyler og større ioner som Ca2 + 15, 16.
Utfordringen med å bruke perforert oppdateringen er potensielt høy serien motstanden. Serien motstand (Rs) eller access motstand er motstand oppdateringen Pipetter i forhold til bakken. Under oppdateringen-klemme innspillinger, Rs vil være parallelt med membran motstand (Rm). Rm og Rs i parallell arbeid som en spenning skillelinjen. Med høy Rs, faller spenningen over Rs gir feil i opptak. Feilen blir større med større strøm registrert. I tillegg er spenning delelinjen også frekvens avhengige oppretter et low pass-filteret, noe som påvirker timelige oppløsningen. Faktisk kan perforert oppdateringen ikke alltid tillate opptak av stor og raskt strømninger som spenningen gated Na+ strøm (for detaljerte lesninger se referanse 19). Også variere Rs under oppdateringen-klemme innspillinger, igjen fører til endringer i registrert gjeldende. Dermed oppstå falske positiver i situasjoner der Rs endres under medikament programmet.
Elektrofysiologi på skiver vevet ble først introdusert av Andersen lab å studere elektrofysiologiske kjennetegner nervecellene i hjernen 20. Teknikken banet vei for detaljert enkeltceller i tillegg til celle-celle kommunikasjon og celle kretser i et mer intakt miljø. En lignende teknikk for å lage hypofysen stykker ble introdusert i 1998 av Guérineau et al. 21. det var imidlertid ikke før 2005 at hjernen-hypofysen skive forberedelse ble brukt med hell i patch-klemme studier i teleost 22. I denne studien rapportert forfatterne også bruk av perforerte patch-klemme innspillinger. Imidlertid langt, er de fleste av elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler utført i pattedyr, og bare en håndfull andre virveldyr, inkludert teleost fisk 1,2,22,23 . I teleoster, ble nesten alle studier utført på primære dissosiert celler 24,25,26,27,28,29,30 .
I dagens papir skissere vi en optimalisert protokoll for utarbeidelse av sunn hjernen-hypofysen skiver fra modellen fisk medaka. Tilnærmingen representerer flere fordeler sammenlignet med primære dissosiert cellekulturer. Først registreres cellene i et relativt bevart miljø forhold til avstand celle kultur forhold. Andre tillate skive forberedelser oss å studere indirekte trasé formidlet av celle-celle kommunikasjon 22, hvilke er ikke mulig i dissosiert celle kultur forhold. Videre viser vi hvordan man skal gjennomføre elektrofysiologiske opptak innhentet vev skiver med perforert hele celle patch-klemme teknikken amfotericin B som pore-forming agent.
Medaka er en liten fisk i Asia hovedsakelig funnet i Japan. Den fysiologi, embryologi og genetikk av medaka har blitt grundig studert for over 100 år 31, og det er en vanligvis anvendt forskning modell i mange laboratorier. Spesielt viktig å dette papiret er forskjellige morfologiske organiseringen av hypothalamus-hypofyse-kompleks i teleost fisk: mens pattedyr og fugler av hypothalamus nevroner løslate deres Nevro-hormoner som regulerer hypofysen endokrine celler i portal system på medianen eminense er det en direkte nervøse projeksjon av hypothalamus nevroner på endokrine cellene i hypofysen i teleost fisk 32. Dermed er nøye gjennomført hjernen-hypofysen kutting av særlig betydning fisk, slik at vi kan undersøke elektrofysiologiske kjennetegner hypofysen cellene i et godt bevart hjernen-hypofysen, og spesielt hvordan hypofysen celler kontrollere deres excitability og dermed Ca2 + homeostase.
Elektrofysiologiske opptak ved hjelp av patch-klemme teknikk på hjernen-hypofysen skiver krever forsiktig optimalisering. Godt optimalisert protokoller for gjennomføring av live-celle undersøkelser i teleoster er begrenset, med fleste publikasjoner bruke protokoller basert på pattedyr systemer. I denne forbindelse er det viktig å være klar over det faktum at flere fysiologiske parametere som pH og osmolality er ikke bare arter avhengig, men også mye avhengig om organismen i spørsmålet bor på land eller i vann. …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ms. LourdesCarreon G Tan for hennes hjelp opprettholde medaka anlegget og Anthony Peltier for illustrerende tallene. Dette arbeidet ble finansiert av NMBU og av Norges forskningsråd, gi tall 244461 (akvakultur program) og 248828 (Digital Livet Norge program).
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
metal molds | SAKURA | 4122 | |
steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
PBS | SIGMA | D8537 | |
Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm |
Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt |
pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-forming antibiotic |
polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI solution |
microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished |
Micro-Manager software | Open Source Microscopy Software | ||
optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
sonicator | Elma | D-7700 singen | |
NaCl | SiGMA | S3014 | |
KCl | SiGMA | P9541 | |
MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
Hepes | SiGMA | H4034 | |
CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
Sucrose | SiGMA | 84097 | |
D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
MES-acid | SIGMA | M0895 | |
BSA | SIGMA | A2153 |