Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos

A hipófise é um órgão endócrino chave nos vertebrados, localizados abaixo do hipotálamo e posteriores para o quiasma óptico. Produz e secreta hormônios de seis a oito dos tipos de célula específica. Hormônios hipofisários constituem um intermediário entre o cérebro e os órgãos periféricos e conduzir a uma grande variedade de processos fisiológicos essenciais, incluindo o crescimento, reprodução e regulação da homeostase. Semelhante a neurônios, células endócrinas da hipófise são eletricamente excitáveis com a capacidade de potenciais de ação de fogo espontaneamente ¹. O papel destes potenciais de ação é dependente de célula. Em vários tipos de células da hipófise mamíferos, potenciais de ação podem elevar o intracelular Ca^{2 +} suficientemente para uma liberação sustentada de hormônio ². Além disso, a hipófise recebe informações estimulatórios e inibitórias do cérebro que afeta o potencial de membrana das células ^3,4,5,6. Normalmente, entrada estimulatório aumenta a excitabilidade e muitas vezes envolve a liberação de Ca^{2 +} de lojas intracelulares bem como aumentou a frequência ⁷a disparar. Compreender como a célula utiliza a composição de canais de íon e adapta-se a estes sinais de entrada do cérebro é chave para a síntese de hormônio de compreensão e libertação.

A técnica da remendo-braçadeira foi desenvolvida na década de 1970 pela Sakmann e Neher ^8,9,10 e melhorada pelo Hamill ¹¹e permite investigações detalhadas das propriedades eletrofisiológicas das células até canais de íon único. Além disso, a técnica pode ser usada para estudar a corrente e a tensão. Hoje, remendo de aperto é o padrão de ouro para medir propriedades eletrofisiológicas da célula. Quatro configurações principais da técnica patch-clamp selo apertado foram desenvolvidos ¹¹; o celular conectado, de dentro para fora, o fora-out e o patch de células inteiras. As três primeiras configurações são normalmente utilizadas para investigações de canal único íon. Para o quarto, seguindo a configuração de conexão de celular, um buraco na membrana celular é feito usando a pressão atmosférica sub. Esta configuração também permite que as investigações da composição iônica canal do celular total ¹². No entanto, uma limitação dessa técnica é que moléculas citoplasmáticas são diluídas pelo patch pipeta solução ¹³ (Figura 1A), afetando as respostas elétricas e fisiológicas das células estudadas. Na verdade, algumas dessas moléculas podem desempenhar um papel importante na transdução do sinal ou na regulação dos canais iônicos diferentes. Para evitar isso, Lindau e Fernandez ¹⁴ desenvolveu um método onde um composto formadoras de poros é adicionado para a pipeta de remendo. Após a configuração de conexão de celular, o composto irá incorporar a membrana plasmática sob o patch e lentamente perfurar a membrana criando contato elétrico com o citosol (Figura 1B). Podem ser usado vários diferentes antifúngicos tais como nistatina ¹⁵ e anfotericina B ¹⁶, ou surfactantes como o beta-escina de saponina ^17,18 . Estes compostos criar poros grandes o suficiente para permitir que o cátion monovalente e Cl^– difusão entre o citosol e a pipeta de remendo, preservando os níveis citosólico de macromoléculas e o maiores íons como Ca^{2 + 15, 16}.

O desafio de usar patch perfurada é a resistência série potencialmente elevados. Resistência série (R_s) ou acesso de resistência é a resistência combinada sobre a pipeta de remendo em relação ao solo. Durante as gravações do remendo-braçadeira, o R_s será em paralelo com a resistência da membrana (R_m). R_m e R_s em trabalho paralelo como um divisor de tensão. Com a alta R_s, a tensão vai cair o R_s dando erros nas gravações. O erro se tornará maior com maiores correntes gravadas. Além disso, o divisor de tensão é também frequência dependente, criando um filtro passa-baixa, afectando assim a resolução temporal. Com efeito, o patch perfurado pode não sempre permitir gravações do grandes e rápidas as correntes como a voltagem dependente correntes at⁺ (para leituras detalhadas consulte referência ¹⁹). Além disso, R_s pode variar durante gravações de remendo-braçadeira, novamente, levando a mudanças na corrente gravada. Assim, falsos positivos podem ocorrer em situações onde R_s muda durante a aplicação da droga.

A eletrofisiologia no tecido cortado foi introduzida primeiramente pelo laboratório para o estudo eletrofisiológicas características dos neurônios no cérebro ²⁰Andersen. A técnica pavimentou o caminho para investigações detalhadas de células únicas, bem como circuitos de comunicações e célula célula célula num ambiente mais intacto. Uma técnica semelhante para fazer fatias da hipófise foi introduzida em 1998 por Guérineau et al ²¹. no entanto, não foi antes de 2005, que a preparação da fatia do cérebro-hipófise foi usada com sucesso para estudos de remendo-braçadeira em teleósteos ²². Neste estudo, os autores também relataram o uso de gravações de remendo-braçadeira perfurada. No entanto, de longe, a maioria das investigações eletrofisiológicas das células da hipófise foram realizada em mamíferos e apenas um punhado de outros vertebrados, incluindo peixes teleósteos ^1,2,22,23 . Em teleósteos, quase todos os estudos foram realizados em células dissociadas primária ^24,25,26,,^27,28,29,30 .

No presente trabalho, descrevem um protocolo otimizado para preparação de fatias de cérebro-hipófise saudáveis de medaka de peixe o modelo. A abordagem representa várias vantagens em comparação com as culturas de células dissociadas primário. Primeiro, as células são gravadas em um ambiente relativamente preservado em relação ao dissociar as condições de cultura celular. Em segundo lugar, preparações de fatia nos permitem estudar vias indiretas, mediadas por célula-célula comunicação ²², que não é possível em condições de cultura de células dissociadas. Além disso, demonstraremos como realizar gravações eletrofisiológicas sobre as fatias de tecido obtidos utilizando a técnica de perfurada células inteiras remendo-braçadeira com anfotericina B como o agente de formação de poros.

Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrada principalmente no Japão. A fisiologia, embriologia e genética do medaka têm sido muito estudadas por mais de 100 anos, ³¹, e é um modelo de pesquisa comumente usado em muitos laboratórios. De particular importância para este papel é a organização morfológica distinta do complexo hipotálamo-hipófise em peixes teleósteos: Considerando que em mamíferos e aves, os neurônios do hipotálamo liberar os neuro-hormônios regulam as células endócrinas da hipófise para o sistema portal da Eminência mediana, há uma projeção nervosa direta dos neurônios hipotalâmicas para as células endócrinas da hipófise em peixes teleósteos ³². Assim, corte cuidadosamente conduzido de cérebro-hipófise é de particular importância no peixe, que nos permite investigar características eletrofisiológicas das células da hipófise em uma rede de cérebro-hipófise bem preservada e em particular como na hipófise células controlar sua excitabilidade e, assim, a homeostase de Ca^{2 +} .