I artikeln beskrivs en optimerad protokollet för att göra lönsamma hjärnan-hypofys vävnad skivor, använder den lever fisk medaka (Oryzias latipes), följt av elektrofysiologiska inspelningar av hypofysen celler med hjälp av patch-clamp teknik med den perforerad patch konfiguration.
Elektrofysiologiska utredningar av hypofysen celler har utförts i många ryggradsdjur, men väldigt få i lever fisk. Bland dessa, har en klar majoritet utförts på dissocierade primära celler. Att förbättra vår förståelse av hur lever hypofysen celler, beter sig i en mer biologiskt relevant miljö, visar detta protokoll hur man förbereder livskraftig hjärnan-hypofys skivor med de små sötvattensfisk medaka (Oryzias latipes). Att göra hjärnan-hypofys skivor, justerades pH och osmolalitet på alla lösningar till värdena i kroppsvätskor sötvattensfisk lever vid 25 till 28 ° C. Efter slice beredningen skall visar protokollet hur man genomför elektrofysiologiska inspelningar med perforerade hela-cell patch-clamp teknik. Patch-clamp tekniken är ett kraftfullt verktyg med oöverträffad temporal upplösning och känslighet, så att utredningen av elektriska egenskaper från intakt hela celler ned till enstaka jonkanaler. Perforerad plåstret är unikt genom att det håller intracellulära miljön intakt hindrar reglerande element i cytosolen från späds ut av patch pipett elektrod lösningen. Däremot när du utför traditionella hela-cell inspelningar, observerades det att medaka hypofysen celler snabbt förlorar sin förmåga att brand handlingspänningar. Bland de olika perforering teknikerna tillgängliga visar detta protokoll hur att uppnå perforering av lappat membranet med fungicid amfotericin B.
Hypofysen är en nyckel endokrina organ hos ryggradsdjur ligger nedanför hypotalamus och posteriort den optiska chiasm. Den producerar och utsöndrar sex till åtta hormoner från de specifika celltyper. Hypofysen hormoner utgör en intermediär mellan hjärnan och perifera organ och köra ett brett utbud av grundläggande fysiologiska processer, inklusive tillväxt, reproduktion och reglering av homeostas. Liknande till nervceller, endokrina celler i hypofysen är elektriskt retbara med möjlighet att avfyra handlingspänningar spontant 1. Dessa nervimpulsernas roll är cellen beroende. I flera celltyper av däggdjur hypofysen, kan handlingspänningar höja den intracellulära Ca2 + tillräckligt för en fördröjd frisättning av hormon 2. Dessutom får hypofysen både stimulerande och hämmande information från hjärnan som påverkar membranet potential celler 3,4,5,6. Typiskt, stimulerande input ökar retbarhet och ofta involverar frisättning av Ca2 + från intracellulära butiker samt ökade bränning frekvens 7. Förstå hur cellen använder ion kanal sammansättning och anpassar sig till dessa signaler från hjärnan är nyckeln till förståelse hormon syntes och frisättning.
Patch-clamp tekniken utvecklades i slutet av 1970 av Sakmann Stuttgart och Neher 8,9,10 och förbättras ytterligare genom Hamill 11, och tillåter detaljerade undersökningar av elektrofysiologiska egenskaper hos celler ner till enda jonkanaler. Tekniken kan dessutom användas för att studera både ström och spänning. Idag är patch-fastspänning den gyllene standarden för att mäta elektrofysiologiska egenskaper av cellen. Fyra stora konfigurationer av tät förslutning patch-clamp teknik har varit utvecklade 11; den cell-anslutna, inifrån och ut, utsidan-out och hela-cell plåstret. De tre första konfigurationerna används vanligtvis för enda Jonen kanaliserar utredningar. För det fjärde, efter den cell-anslutna konfigurationen, görs ett hål i cellmembranet med hjälp av sub atmosfäriska trycket. Denna konfiguration tillåter också utredningar av ion kanal sammansättningen av hela cellen 12. En begränsning med denna teknik är dock att cytoplasmiska molekyler späds av patch pipett lösning 13 (figur 1A), vilket påverkar de elektriska och fysiologiska Svaren studerade celler. Några av dessa molekyler kan faktiskt spelar viktiga roller i transduktion av signalen eller i regleringen av olika jonkanaler. För att undvika detta, utvecklat Lindau och Fernandez 14 en metod där en por-bilda förening läggs till patch pipetten. Efter den cell-anslutna konfigurationen, föreningen kommer att införliva i plasmamembranet under plåstret och långsamt perforate membranet att skapa elektrisk kontakt med cytosolen (figur 1B). Flera olika antimykotika såsom nystatin 15 och amfotericin B 16eller ytaktiva ämnen såsom den saponin beta-escin 17,18 kan användas. Dessa föreningar skapa porer som är tillräckligt stor för att tillåta monovalenta ering och Cl– diffusion mellan cytosolen och patch pipetten samtidigt bevara de cytosoliska nivåerna av makromolekyler och större joner som Ca2 + 15, 16.
Utmaningen att använda perforerade patch är potentiellt hög serie motstånd. Serie motstånd (Rs) eller access motstånd är det kombinera motståndet över patch pipetten i förhållande till marken. Under patch-clamp inspelningar, den Rs kommer vara parallellt med membran motstånd (Rm). Rm och Rs i parallell arbete som en spänningsavdelare. Med hög Rs, faller spänningen över den Rs ger fel i inspelningarna. Felet blir större med större strömmar registreras. Spänningsavdelaren är dessutom också frekvens beroende skapar ett lågpassfilter, vilket påverkar den temporal upplösningen. I praktiken tillåta perforerade plåstret inte alltid inspelningar av stora och snabba strömmar som spänningen gated Na+ strömmar (för detaljerade avläsningar se referens 19). Rs kan dessutom variera under patch-clamp inspelningar, igen leder till förändringar i den inspelade aktuellt. Således, falska positiva kan uppstå i situationer där Rs ändras under drog ansökan.
Elektrofysiologi på skivad vävnad introducerades av Andersen lab att studera elektrofysiologiska egenskaper av nervcellerna i hjärnan 20. Tekniken banade väg för detaljerade undersökningar av enstaka celler liksom cell-cell kommunikation och cell kretsar i en mer intakt miljö. En liknande teknik för att göra hypofysen skivor introducerades 1998 av Guérineau et al. 21. det var dock inte före 2005, hjärnan-hypofys slice preparatet används framgångsrikt för patch-clamp studier i lever 22. I denna studie rapporterade författarna också användningen av perforerade patch-clamp inspelningar. Dock överlägset har de flesta av de elektrofysiologiska undersökningarna av hypofysen celler utförts hos däggdjur, och endast en handfull andra ryggradsdjur, inklusive lever fisk 1,2,22,23 . I Benfiskar utfördes nästan alla studier på primära dissocierade celler 24,25,26,27,28,29,30 .
I detta dokument beskriver vi en optimerad protokollet för beredning av friska hjärnan-hypofys skivor från den modell fisk medaka. Metoden representerar flera fördelar jämfört med primär dissocierade cellkulturer. Först registreras cellerna i en relativt bevarad miljö jämfört med separerade cell odlingsbetingelser. Andra, slice preparat tillåter oss att studera indirekta vägar medieras av cell-cell kommunikation 22, vilket inte är möjligt i dissocierade cell odlingsbetingelser. Dessutom visar vi hur man genomför elektrofysiologiska inspelningar på erhållna vävnad skivor med perforerade hela-cell patch-clamp teknik med amfotericin B som por-bilda agent.
Medaka är en liten sötvattensfisk som infödda till Asien, främst hittat i Japan. I fysiologi, embryologi och genetik av medaka har studerats för över 100 år 31, och det är en vanligt förekommande forskning modell i många laboratorier. Av särskild betydelse för denna uppsats är den distinkta morfologiska organisationen av hypotalamus-hypofys komplexet i lever fisk: medan hos däggdjur och fåglar hypotalamus nervceller släpper sin neuro-hormoner reglerar hypofysen endokrina celler in i portalen systemet av den medianen eminens finns det en direkt nervös projektion av hypotalamus nervceller på hypofysen i lever fisk 32endokrina celler. Därför är noggrant genomförda hjärnan-hypofys skivning av särskild betydelse i fisk, vilket tillåter oss att undersöka elektrofysiologiska egenskaper av hypofysen celler i en välbevarad hjärnan-hypofys-nätverk, och i synnerhet hur hypofysen celler styra sin retbarhet och därmed Ca2 + homeostas.
Elektrofysiologiska inspelningar med hjälp av patch-clamp teknik på hjärnan-hypofys skivor kräver noggrann optimering. Väl optimerade protokoll för genomför live-cell undersökningar särskilt i Benfiskar är begränsade, med majoriteten av publikationer med protokoll baserat på däggdjur system. I detta sammanhang är det viktigt att vara medveten om det faktum att flera fysiologiska parametrar som pH och osmolalitet är inte bara arter beroende, men också mycket beroende av huruvida den ifrågavarande organism…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Ms. LourdesCarreon G Tan för hennes hjälp att upprätthålla medaka anläggningen och Anthony Peltier för belysande siffrorna. Detta arbete finansierades av NMBU och av Norges forskningsråd, grant nummer 244461 (vattenbruk program) och 248828 (Digital liv Norge program).
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
metal molds | SAKURA | 4122 | |
steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
PBS | SIGMA | D8537 | |
Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm |
Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt |
pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-forming antibiotic |
polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI solution |
microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished |
Micro-Manager software | Open Source Microscopy Software | ||
optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
sonicator | Elma | D-7700 singen | |
NaCl | SiGMA | S3014 | |
KCl | SiGMA | P9541 | |
MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
Hepes | SiGMA | H4034 | |
CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
Sucrose | SiGMA | 84097 | |
D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
MES-acid | SIGMA | M0895 | |
BSA | SIGMA | A2153 |