यहां, हम बताते है कि कैसे एक निकटता बंधाव परख (पीएलए) का उपयोग करने के लिए उच्च संवेदनशीलता के साथ तय की कोशिकाओं में MST1/MST2 heterodimerization कल्पना ।
विनियमित प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत कई संकेतन घटनाओं के लिए एक मार्गदर्शक सिद्धांत हैं, और इस तरह की घटनाओं का पता लगाने कैसे इस तरह के रास्ते का आयोजन कर रहे हैं और कैसे वे समारोह को समझने में एक महत्वपूर्ण तत्व है. वहाँ कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन अपेक्षाकृत कुछ अंतर्जात प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ऐसी ही एक विधि, निकटता बंधाव परख (पीएलए), इसके उपयोग की सिफारिश करने के लिए कई फायदे हैं । प्रोटीन के अंय आम तरीकों के मुकाबले प्रोटीन संपर्क विश्लेषण, पीएलए अपेक्षाकृत उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है, ंयूनतम सेल हेरफेर के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, और, प्रोटोकॉल में वर्णित यहां, केवल दो लक्ष्य विशेष की आवश्यकता है विभिंन प्रजातियों से व्युत्पंन एंटीबॉडी (जैसे, माउस और खरगोश से) और एक विशेष एजेंट: माध्यमिक एंटीबॉडी कि covalently विशिष्ट oligonucleotides है कि, जब एक दूसरे के करीब निकटता में लाया से जुड़े रहे है का एक सेट, बनाएं सीटू पीसीआर या रोलिंग सर्कल प्रवर्धन में के लिए प्रवर्धित मंच । इस प्रस्तुति में, हम MST1 और MST2 निकटता में तय कोशिकाओं में बदलाव की कल्पना करने के लिए पीएलए तकनीक लागू करने के लिए कैसे दिखाते हैं । इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक सेल सिग्नलिंग अध्ययन के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से लागू है ।
MST1/हिप्पो संकेतन के विघटन विकासात्मक विकारों और कैंसरजनन1से जुड़ा हुआ है । स्तनधारी में, kinases MST1 और MST2 सक्रिय (phosphorylate) MOB1 और LATS1/2, के बाद जो फिर phosphorylates और निष्क्रिय transcriptional सह उत्प्रेरक हां-जुड़े प्रोटीन (याप)2। अपने सक्रिय (unphosphorylated) रूप में, याप oncogenic गतिविधि है, कोशिका प्रसार जीन की प्रतिलेखन बढ़ाने; इसके विपरीत, जब याप हिप्पो मार्ग द्वारा निष्क्रिय है, सेल प्रसार दबा दिया और apoptosis3पदोंनत किया है । ऊतकों में, MST1 और MST2 सक्रिय homodimers के रूप में मुख्य रूप से मौजूद हैं, लेकिन oncogenic उत्तेजनाओं MST1 के स्तर में वृद्धि कर सकते हैं/MST2 heterodimers, और इस तरह के heterodimers निष्क्रिय कर रहे हैं4. हालांकि, कैसे MST1/MST2 heterodimerization विनियमित है खराब समझ में आता है । दोनों होमो-और heterodimers सी के बीच बातचीत के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं-टर्मिनल कुंडलित MST1 और MST2 सारा डोमेन5के रूप में जाना के क्षेत्रों का तार । एक सीटू पीएलए में इस लेख में प्रदर्शन का प्रयोग, हम MST1/MST2 heterodimers की उपस्थिति मानव Schwann कोशिकाओं (HSC) और मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK-२९३) में दिखाते हैं । पीएलए अन्य प्रोटीन पर एक फायदा है/प्रोटीन इंटरेक्शन डिटेक्शन तरीके क्योंकि यह अंतर्जात प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, जो transgene अभिव्यक्ति की आवश्यकता के बिना quantified और epitope टैग के उपयोग की पहचान की जा सकती है 6.
संकेत transduction रास्ते काफी हद तक घटक प्रोटीन की सशर्त संघ द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, सबसे रिसेप्टर tyrosine kinases की उत्तेजना अपने होमो-या hetero-dimerization और अतिरिक्त intracellular संकेतन प्रोटीन, जो खुद आगे परिसरों के फार्म के साथ बाद में सहयोग करने के लिए सुराग । पीएलए विधि के उद्देश्य से कोशिकाओं में प्रोटीन के बीच निकटता की कल्पना है, बशर्ते कि प्रोटीन से कम 30-40 एनएम के अलावा कर रहे हैं । प्रोटीन निकटता आमतौर पर उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को अलग प्रजातियों में उठाया द्वारा पता लगाया है (जैसे, खरगोश और माउस) प्रत्येक बातचीत प्रोटीन के खिलाफ है, तो प्रजातियों-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने, पूर्व में लघु डीएनए जांच को मिलकर. यदि डीएनए जांच बंद निकटता में हैं, एक विशिष्ट जोड़ने डीएनए oligonucleotide एक साथ इन जांच के दोनों बांध कर सकते हैं, प्रवर्धन के लिए एक मंच बनाने के द्वारा सीटू पीसीआर में या वृत्त तंत्र रोलिंग द्वारा । फ्लोरोसेंट टैग प्रवर्धन प्रतिक्रिया को जोड़ा गया बातचीत प्रोटीन के दृश्य की अनुमति है, जो फ्लोरोसेंट डॉट्स कि आसानी से quantified जा सकता है और सेल में विशेष क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत के रूप में प्रकट7,8, 9 , 10.
हम इस प्रयोग के लिए ग्लास चैंबर स्लाइड का उपयोग करने के लिए उपयोगी पाया, के रूप में यह बहुत (14-16) सेल लाइनों के साथ प्रयोग करने के लिए सुविधाजनक है और कोई नमूना माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के दौरान हर बार बदलने …
The authors have nothing to disclose.
हम अनुकूलन और इस प्रोटोकॉल के सत्यापन में योगदान के लिए पूरी Chernoff प्रयोगशाला धंयवाद, विशेष रूप से मारिया रडू और Galina Semenova में । हम भी फॉक्स चेस कैंसर सेंटर में सेल इमेजिंग सुविधा के एंड्री Efimov धंयवाद । इस कार्य को NIH (R01 CA148805) से जे. पी. ए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |