原位近接结扎法检测蛋白异构体的 Heterodimerization
Summary
在这里, 我们展示了如何使用接近结扎法 (PLA) 在高灵敏度的固定细胞中可视化 MST1/MST2 heterodimerization。
Abstract
调控蛋白质-蛋白质相互作用是许多信号事件的指导原则, 而检测此类事件是了解这些途径是如何组织和如何运作的重要因素。在细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法很多, 但相对较少的人可以用来检测内源蛋白之间的相互作用。一个这样的方法, 近距离结扎法 (PLA), 有几个优点, 建议使用它。与其他常用的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法相比, PLA 具有较高的灵敏度和特异性, 可以用最小的细胞操作进行, 并且, 在本文所述的协议中, 只需要两个目标特定的来自不同物种 (例如, 从老鼠和兔子) 和一个专门试剂的抗体: 一组与特定的寡核苷酸共价连接的二次抗体, 当彼此靠近时, 产生一个扩增原位PCR 或滚动圆扩增的平台。在本演示中, 我们展示了如何应用 PLA 技术来可视化固定细胞中 MST1 和 MST2 接近的变化。本手稿中描述的技术特别适用于细胞信号研究的分析。
Introduction
MST1/Hippo 信号的中断已连接到发育紊乱和癌变1。在哺乳动物中, 激酶 MST1 和 MST2 激活 (磷酸化) MOB1 和 LATS1/2, 后者随后 phosphorylates 和失活转录共同激活剂 Yes 相关蛋白 (叶)2。在其活性 (unphosphorylated) 形式中, 叶叶具有致癌活性, 增强细胞增殖基因的转录;反之, 当叶叶被河马通路灭活时, 细胞增殖被抑制, 凋亡提升3。在组织中, MST1 和 MST2 主要作为活性 homodimers 存在, 但致癌刺激可以增加 MST1/MST2 异的水平, 这种异是不活动的4。然而, MST1/MST2 heterodimerization 的监管方式仍然不甚了解。通过MST1 和 MST2 (称为萨拉域5) 之间的相互作用, 可以介导异和均质。本文用原位PLA 演示了 MST1/MST2 异在人雪旺细胞 (HSC) 和人胚肾细胞 (HEK-293) 中的存在。PLA 优于其他蛋白质/蛋白质相互作用检测方法, 因为它允许检测内源蛋白-蛋白质相互作用, 可以识别和量化, 无需转基因表达或使用表位标记6。
信号传导通路主要由成分蛋白的条件关联控制。例如, 大多数受体酪氨酸激酶的刺激导致他们的二聚和随后与其他细胞内信号蛋白的关联, 它们本身形成进一步的复合物。PLA 方法的目的是可视化细胞中蛋白质之间的接近, 只要蛋白质小于 30-40 nm。蛋白质接近通常是通过在不同的物种 (例如, 兔子和老鼠) 中培养出适当的原代抗体, 然后添加特定于物种的二次抗体, 来检测细胞,预耦合到短 DNA 探针。如果 dna 探针接近, 一个特定的链接 dna 寡核苷酸可以同时绑定这些探针, 形成一个平台, 通过原位PCR 或滚动循环机制进行放大。添加到扩增反应中的荧光标记允许可视化的相互作用的蛋白质, 它显示为荧光点, 可以很容易地量化和本地化到单元格7,8中的特定区域,9,10。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们发现在这个实验中使用玻璃腔玻片是很有用的, 因为它非常方便地进行了几个 (14-16) 细胞系的实验, 并且在显微分析过程中无需每次更换样品。可能会出现一些并发症, 如抗体交叉污染的风险增加。因此, 我们建议单独洗涤, 而不是使用 Coplin 罐, 尽管实验持续时间延长。此外, 去除硅胶插入物是一件微妙的事情, 必须小心和耐心地做。即使采用细致的技术, 在移除刀片后, 有时也可以看到少量的硅…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢整个切尔诺夫实验室为本议定书的优化和验证作出贡献, 特别是玛丽亚 Radu 和加林娜 Semenova。我们还感谢安德烈 Efimov 在福克斯大通癌症中心的细胞成像设施。这项工作得到了 NIH (R01 CA148805) 授予 JC 的资助。
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
Referências
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