Rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando un'analisi in Situ vicinanza legatura
Summary
Qui, vi mostriamo come utilizzare un dosaggio di legatura di prossimità (PLA) per visualizzare MST1/MST2 eterodimerizzazione in celle fisse con alta sensibilità.
Abstract
Interazioni proteina-proteina regolamentati sono un principio guida per molti eventi di segnale, e l’individuazione di tali eventi è un elemento importante nella comprensione di come tali percorsi sono organizzati e come funzionano. Ci sono molti metodi per rilevare le interazioni proteina-proteina in cellule, ma relativamente pochi può essere utilizzati per rilevare le interazioni tra proteine endogene. Uno di questi metodi, il dosaggio di legatura di prossimità (PLA), ha diversi vantaggi per raccomandare l’uso. Rispetto ad altri comuni metodi di analisi di interazione proteina-proteina, PLA ha relativamente alta sensibilità e specificità, possa essere eseguita con la manipolazione di cellule minimal e, nel protocollo descritto nel presente documento, richiede solo due target-specifici anticorpi derivati da specie diverse (ad es., da topo e coniglio) e un reagente specializzato: un set di anticorpi secondari che sono oligonucleotidi covalentemente legati a specifiche che, quando ha portato in prossimità di un altro, creare un amplificabile piattaforma per in situ PCR o rotolamento dell’amplificazione del cerchio. In questa presentazione, mostreremo come applicare la tecnica PLA per visualizzare le modifiche in prossimità di MST1 e MST2 nelle celle fisse. La tecnica descritta in questo manoscritto è particolarmente applicabile per l’analisi di studi di segnalazione delle cellule.
Introduction
Rottura di MST1/Hippo segnalazione è stata collegata a disturbi dello sviluppo e carcinogenesi1. Nei mammiferi, attivano le chinasi MST1 e MST2 (fosforilare) MOB1 e LATS1/2, il secondo dei quali poi fosforila ed inattiva co-l’attivatore trascrizionale Yes-associated protein (YAP)2. Nella sua forma attiva (unphosphorylated), YAP ha attività oncogena, migliorando la trascrizione dei geni di proliferazione delle cellule; al contrario, quando YAP è inattivato dalla via del Hippo, è soppressa la proliferazione cellulare e apoptosi promosso3. Nei tessuti, MST1 e MST2 esiste principalmente come attivo omodimeri, ma stimoli oncogeni possono aumentare i livelli di MST1/MST2 eterodimeri, e tali eterodimeri sono inattivo4. Tuttavia, com’è regolata la MST1/MST2 eterodimerizzazione rimane capita male. Omo – ed eterodimeri sono mediati tramite interazioni tra regioni arrotolato-arrotola C-terminale di MST1 e MST2 conosciuta come SARAH domini5. Utilizzando un in situ PLA ha dimostrato in questo articolo, ci mostrano la presenza di MST1/MST2 eterodimeri in cellule di Schwann umane (HSC) e rene embrionale umano cellule (HEK-293). PLA ha un vantaggio rispetto ad altri metodi di rilevazione di interazione proteina/proteina perché permette la rilevazione delle interazioni proteina-proteina endogena, che possono essere individuati e quantificati senza la necessità di espressione del transgene o l’uso di epitopo 6.
Vie di trasduzione del segnale sono in gran parte controllate dall’associazione condizionale delle proteine di componente. Per esempio, stimolazione della maggior parte dei recettori tirosina chinasi conduce alla loro omo – o etero-dimerizzazione e la successiva associazione con altre proteine di segnalazione intracellulare, che a loro volta formare ulteriori complessi. Lo scopo del metodo PLA è visualizzare la vicinanza tra le proteine nelle cellule, purché le proteine sono meno di 30-40 nm apart. Prossimità di proteina è rilevata solitamente incubando le cellule con gli anticorpi primari appropriati generati in specie diverse (ad es., coniglio e il mouse) contro ogni proteina d’interazione, quindi aggiungendo specie-specifici anticorpi secondari, sonde di DNA pre-accoppiato a breve. Se le sonde del DNA sono nelle immediate vicinanze, un oligonucleotide specifico collegamento DNA possibile associare contemporaneamente sia di queste sonde, formando una piattaforma per l’amplificazione in situ PCR o dal meccanismo del cerchio di rotolamento. Fluorescente tag aggiunti per la reazione di amplificazione permettono la visualizzazione delle proteine interagenti, che appaiono come puntini fluorescenti che possono essere facilmente quantificate e localizzate alle regioni particolari nella cella7,8, 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo trovato utile utilizzare vetrini camera per questo esperimento, come è molto conveniente eseguire l’esperimento con diverse linee di cellule (14-16) e non c’è nessuna necessità di cambiare il campione ogni volta durante l’analisi in microscopia. Alcune complicazioni possono sorgere, ad esempio un aumentato rischio di contaminazione incrociata con gli anticorpi. Pertanto, consigliamo di lavare ogni pozzetto singolarmente anziché utilizzare una vaschetta di Coplin, nonostante l’aumento della durata dell’esperim…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’intero laboratorio Chernoff per contribuire alla ottimizzazione e convalida del presente protocollo, in particolare Maria Radu e Galina Semenova. Ringraziamo anche Andrey Efimov della struttura cellulare Imaging presso il Fox Chase Cancer Center. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal NIH (R01 CA148805) a JC.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
Referências
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
