Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu
Summary
Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.
Abstract
LEISHMANIA, hastalığının leishmaniasis, yaşam döngüsü içinde böcek promastigote ve amastigote aşamaları ile omurgalı ana bilgisayarları arasında sırasıyla geçiş yapar. Patojenik leishmaniasis belirtileri çok, son derece ölümcül visseral hastalık formlara infektif tür bağlı olarak benign Kutanöz lezyonlarin üzerinden değişebilir iken tüm LEISHMANIA tür omurgalı aşaması sırasında ana bilgisayar makrofajlar içinde bulunan onların yaşam döngüsü. LEISHMANIA infektivite bu nedenle işgal, hayatta kalmak ve makrofajlar içinde parasitophorous boşluklar (PVs) içinde çoğaltmak için onun yetenek için doğrudan ilgilidir. Böylece, asıl olayın asalağın intracellularly çoğaltmak yeteneği değerlendirmek virülans belirlemek için güvenilir bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Hayvan modelleri kullanarak leishmaniasis geliştirme eğitim zaman alıcı, sıkıcı ve çoğu zaman zor, özellikle pathogenically önemli visseral formlarla. Biz burada makrofajlar (BMMs) kemik iliği elde edilen hücre içi LEISHMANIA gelişiminde izlemek için bir metodoloji açıklayın. İntrasellüler parazit numaraları, 72-96 h enfeksiyonu takip için 24 saat aralıklarla belirlenir. Bu yöntem güvenilir bir tayin edilmesi LEISHMANIA virülans çeşitli genetik faktörlerin etkilerini tanır. Örnek olarak, biz nasıl bozar tek gen silme LEISHMANIA mitokondrial demir taşıyıcı gen (LMIT1) LEISHMANIA amazonensis mutant suşu LMIT1/ΔLmit1 yetenek BMMs içinde büyümeye göstermek, sert bir düşüş vahşi-türüne göre virülans yansıtan. Bu tahlil de ayrı ayrı ana bilgisayar-patojen etkileşim çeşitli faktörler (besin, Reaktif oksijen türleri, vb) etkisi analiz etmek için manipüle edilebilir deneysel koşullar hassas kontrol sağlar. Bu nedenle, uygun yürütme ve miktar BMM enfeksiyon çalışmaların geleneksel hayvan modeli çalışmaları için non-invaziv, hızlı, ekonomik, güvenli ve güvenilir bir alternatif sağlar.
Introduction
Leishmaniasis insan hastalıkları protozoon parazit türü LEISHMANIAtarafından neden olduğu geniş bir yelpazede anlamına gelir. Yaklaşık 12 milyon kişi şu anda LEISHMANIA ile dünya çapında bulaşmış ve 350 milyondan fazla risk altındadır. Hastalık patoloji LEISHMANIA türler ve ana faktöre bağlıdır ve belirtiler zararsız kendi kendini iyileştirme deri lezyonları ölümcül visceralizing formları için değişir. Tedavi edilmezse, viseral leishmaniasis ölümcül ise, en ölümcül insan hastalık olarak sıtma sonra sıralama neden olduğu enfeksiyon protozoon parazit1. Hastalık patoloji ve belirtiler geniş kapsamlı görüş farklılıklarına rağmen tüm LEISHMANIA tür bir digenic sırasıyla promastigote ve amastigote aşamaları içinde böcek ve omurgalı ana bilgisayarlar arasında değişen ömrü var. İç omurgalılar, LEISHMANIA ana bilgisayar makrofajlar işgali için hedef ve parasitophorous boşluklar (PVs), nerede son derece öldürücü amastigote formları çoğaltmak asidik bölmeleri ile phagolysosomes özelliklerini oluşumu teşvik. Amastigotes ana bilgisayar dokularda kronik enfeksiyonlar sırasında kalıcı ve bulaşmamış olduğu için ileri sandflies, iletim döngüsü tamamlanıyor geçirilebilir. Bu nedenle, insan hastalığı geliştirme bağlamında, amastigotes en önemli LEISHMANIA yaşam döngüsü formu2vardır. Nasıl amastigotes içinde makrofaj PVs çoğaltmak araştıran ve anlayış LEISHMANIA virülans3,4,5,6,7 için kritik roman etkili tedaviler geliştirilmesi.
Biz burada düzenli olarak LEISHMANIA enfeksiyon ve hücre içi LEISHMANIA sayısı kantitatif değerlendirilmesi zamanla içeren makrofajlar (BMMs), kemik iliği türevi çoğaltmasında çalışmaya bizim laboratuvar tarafından kullanılan bir yöntem açıklanmaktadır. Fare kemik iliği ve farklılaşma monosit kültür makrofajlar, vitro enfeksiyon infektif formları (metacyclic promastigotes veya amastigotes) ile LEISHMANIA ve miktar, hasat işlemi içerir 72-96 h enfeksiyon sonrasında bir süre için her 24 saat aralıklarla intrasellüler parazit sayısı. Bu tahlil çeşitli çevresel faktörler ve parazit genler daha da footpad tarafından doğrulandı L. amazonensis virülans teşvik demir kritik rol kimliği de dahil olmak üzere, etkisini belirlemek için bizim laboratuvar olarak kullanılmıştır lezyon belirleme çalışmaları, fareler6,8,9,10,11,12,13,–14,15 . Bütün patojenik LEISHMANIA türlerin ana bilgisayar makrofajlar içinde ikileştirici onların niş kurmak, bu tahlil evrensel olarak tüm LEISHMANIA türlerin virülans tespitler için kullanılabilir.
BMM enfeksiyonlar yapmadan tek hücre düzeyinde ana bilgisayar-parazit etkileşimlerin analizi ve böylece nasıl LEISHMANIA parazitler makrofajlar PVs onların tercih edilen ana microenvironment ile etkileşim daha kapsamlı bir anlayış olanağı sağlar. Makrofaj enfeksiyon deneyleri başarılı bir şekilde birden çok grupları16,17,18,19,20,21,22 tarafından keşfetmek için kullanılmıştır işlevleri hem ana bilgisayar makrofaj ve LEISHMANIA belirli genler ve hücre içi enfeksiyon karakterize karmaşık etkileşim potansiyel onların katılımı. Miktar microbicidal nitrik oksit üretimi, Reaktif oksijen türleri nesil ve diğer olumsuz koşullar gibi hücre içi hayatta kalma etkileyen ana faktörler etkisinin bir okuma olarak parazit büyümenin BMM enfeksiyonlar izin içinde lysosome benzeri PVs23karşılaştı. Makrofaj enfeksiyon deneyleri de potansiyel anti-leishmanial uyuşturucu müşteri adayları terapötik geliştirme13,24tanımlamak için kullanılmıştır.
Vitro doğa BMM enfeksiyonların LEISHMANIA virülans değerlendirmek için diğer yöntemleri çeşitli avantajlar sağlar. Ancak, zamanla intrasellüler parazit kurtulma mekanizmaları incelerken birkaç önceki çalışmalarda enfeksiyon oranı20,21,24olarak ölçmek değil. Ayrıca, birçok çalışma zamanla vivo içinde enfeksiyonları takip duruldu kutanöz bir lezyon boyutu ve parazit çoğaltma25,–26 yalnızca dolaylı olarak ilgili diğer fizyolojik belirtiler ölçerek yaptım , 27. vivo içinde enfeksiyon parazit virülans değerlendirmek için sıkı bir yaklaşım olmakla birlikte, lezyon boyut ölçüleri footpad yalnız şişme tabanlı çoğu zaman yetersiz, enfekte dokularda inflamatuar yanıt yansıttıkları gibi değil parazitler mutlak sayısı. Bu nedenle, footpad lezyon geliştirme deneyleri, enfekte dokular, parazit seferdeki miktar tarafından takip edilmesi gerek uzun sınırlayıcı seyreltme gerektiren yordamı28deneyleri. Ayrıca, in vivo genellikle farklı noktalarda birden fazla hayvan dokuları faiz6,8,9,10, ayıklamak için zamanında ödün dahil çalışmaları 11 , 13. buna ek olarak, çok sayıda BMMs bir hayvandan elde edilebilir ve bu hücreler enfeksiyonu değerlendirilmesi çeşitli noktalarda zamanında izin koşullar altında kaplama. Ayrıca, in vivo çalışmalar için karşılaştırıldığında, vitro BMM enfeksiyonlar yapmadan deneysel koşullar üzerinde daha fazla denetim olanağı sağlar. Parazitler kendileri ile birlikte bulaşması için makrofajlar miktarının çokluğu enfeksiyon (MOI) ve kültür koşullardan hassas kontrol sağlar. Bu faktörler üzerinde daha iyi denetim anahtar içinde ayrı hücresel yollar özelliklerinin belirlenmesi ve enfeksiyon sahası üzerindeki etkilerini anlamak olabilir.
Bu avantajları göz önüne alındığında, çok az sayıda gruplar LEISHMANIA virülans eğitim defa makrofajlar hücre içi çoğaltma kantitatif değerlendirilmesi tüm avantajlarından almış biraz şaşırtıcıdır. Bu makalede, biz bu tahlil daha kapsamlı kullanımını engelleyici, ve onun düzgün şekilde uygulanmasını kolaylaştırmak için adım adım bir protokol sağlar ortak tuzaklar tartışıyorlar. Onun hassas ve çok yönlülük göz önüne alındığında, biz burada tarif BMM enfeksiyon tahlil, yalnızca ana bilgisayar-patojen etkileşimleri LEISHMANIA virülans etkileyen keşfetmek için aynı zamanda içinde çoğaltma diğer mikroorganizmalar çalışmaya yararlı olabilir değil makrofajlar29. Önemlisi, bu tahlil anti-leishmanial ilaç geliştirme için hızlı ve ekonomik önceden klinik tarama yöntemi olarak da geliştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda açıklanan BMM enfeksiyon tahlil tarafından üretilen Nicel veri sağlar müfettişler enfeksiyon oranları ve güvenilir belirlenmesi virülans yapılan değişikliği (en fazla 2 2 ile karşılaştırıldığında hafta, nispeten daha kısa bir zaman dilimi içinde elde etmek için ay) içinde vivo deneyler için gerekli. Bu yöntem DNA belirli boya DAPI, özellikle makrofaj ve parazit çekirdeği lekeleri ve hızlı kimlik ve enfekte hücreleri miktar sağlayan dayanır. Buna karşılık, Giemsa g…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Sağlık hibe RO1 AI067979 NWA Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
YK Lisans Bursu dan Howard Hughes tıp Enstitüsü/üniversite Maryland College Park, alıcı olduğunu.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
Referências
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
