التحديد الكمي "النمو داخل الخلايا داخل الضامة" هو سريع وطريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم الفوعة طفيليات الليشمانيا
Summary
يقيم جميع الأنواع الليشمانيا المسببة للأمراض وتكرارها داخل الضامة مضيفيهم الفقاريات. نقدم هنا، بروتوكولا لتصيب موريني الضامة المشتقة من نخاع العظام في الثقافة مع ليشمانيا، متبوعاً بالقياس الكمي الدقيق لحركية النمو داخل الخلايا. يعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة العوامل الفردية التأثير على التفاعل المضيف الممرض وضراوة الليشمانيا .
Abstract
دورة حياة الليشمانيا، المسبّب لداء الليشمانيات، التبديل بين المراحل بروماستيجوتي وأماستيجوتي داخل الحشرة والمضيفين الفقارية، على التوالي. بينما يمكن أن تختلف الأعراض المسببة لداء الليشمانيات على نطاق واسع، من آفات جلدية حميدة لأشكال المرض الحشوي فادح جداً تبعاً للأنواع المعدية، جميع أنواع الليشمانيا يقيمون داخل الضامة المضيف أثناء مرحلة الفقاريات حياتها. ليشمانيا العدوى ولذلك ارتباطاً مباشرا بقدرته على غزو، والبقاء على قيد الحياة وتكرارها داخل فاكوليس باراسيتوفوروس (PVs) داخل الضامة. وهكذا، تقييم قدرة الطفيليات تكرار إينتراسيلولارلي يخدم كوسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد ضراوة. دراسة تطوير داء الليشمانيات باستخدام نماذج حيوانية مضيعة للوقت وشاقة وغالباً ما تكون صعبة، لا سيما مع أشكال الحشوي باثوجينيكالي الهامة. يصف لنا هنا منهجية لمتابعة تطور ليشمانيا داخل الخلايا في نخاع العظام المستمدة الضامة (بنغلادش). أرقام الطفيليات داخل الخلايا مصممون على فترات ح 24 عن ح 72-96 بعد الإصابة. يسمح هذا الأسلوب لتحديد آثار مختلف العوامل الوراثية في الفوعة ليشمانيا موثوق بها. على سبيل مثال، نعرض كيفية حذف اليل واحد من الجينات ليشمانيا Mitochondrial الحديد الناقل (LMIT1) يضعف قدرة سلالة متحولة ليشمانيا أمازونينسيس LMIT1/ΔLmit1 تنمو داخل بنغلادش، مما يعكس انخفاض حاد في الفوعة بالمقارنة إلى البرية من نوع. كما يسمح هذا الفحص مراقبة دقيقة للظروف التجريبية، التي يمكن التلاعب بها على حدة لتحليل تأثير العوامل المختلفة (المواد الغذائية، والأنواع الأكسجين التفاعلية، إلخ.) على التفاعل الممرض المضيف. ولذلك، التنفيذ المناسب والتحديد الكمي للدراسات الإصابة بم توفير بديل غير الغازية، والسريع، واقتصادا، ومأمونة وموثوقة للدراسات النموذجية الحيوانية التقليدية.
Introduction
داء الليشمانيات يشير إلى طائفة واسعة من الأمراض البشرية التي تسببها الأنواع الطفيليات الأوالي من جنس الليشمانيا. ما يقرب من 12 مليون شخص مصابون حاليا الليشمانيا في جميع أنحاء العالم، وأكثر من 350 مليون معرضة للخطر. باثولوجيا المرض يعتمد على الأنواع الليشمانيا وعوامل المضيف، وأعراض تختلف من آفات الجلد الشفاء الذاتي حميدة إلى أشكال فيسسيراليزينج الفتاكة. إذا كان داء الليشمانيات الحشوي غير المعالجة، وفادح، الترتيب إلا بعد الملاريا كأشد الأمراض فتكاً البشرية الناجمة عن العدوى مع بروتوزوا1. وعلى الرغم من الاختلافات الواسعة النطاق في علم الأمراض الأمراض والأعراض، يكون جميع الأنواع الليشمانيا دورة حياة ديجينيك بالتناوب بين مراحل بروماستيجوتي وأماستيجوتي داخل الحشرات والفقاريات المضيفين، على التوالي. داخل الفقاريات، ليشمانيا استهداف الضامة المضيف للغزو والحث على تشكيل باراسيتوفوروس فاكوليس (PVs)، المقصورات الحمضية مع خصائص فاجوليسوسوميس فيها تكرار النماذج أماستيجوتي ضراوة شديدة. Amastigotes تستمر في أنسجة المضيف أثناء الالتهابات المزمنة ويمكن تمرير ويلكم إلى الأمام لمصابه، استكمال دورة انتقال. ولذلك، في سياق التنمية البشرية من المرض، amastigotes هي دورة حياة الليشمانيا أهم نموذج2. التحقيق في كيفية تكرار amastigotes داخل بلعم PVs أمر بالغ الأهمية لفهم ليشمانيا الفوعة3،،من45،،من67 تطوير العلاجات الناجعة الرواية.
يصف لنا هنا أسلوب يستخدم بانتظام لدينا مختبر لدراسة ليشمانيا العدوى وتكرارها في المشتقة من نخاع العظم الضامة (بنغلادش)، الذي ينطوي على تقييم كمي لعدد داخل الخلايا ليشمانيا على مر الزمن. وتنطوي العملية على حصاد وحيدات من نخاع العظام الماوس والتمايز الضامة في الثقافة، والعدوى في المختبر مع أشكال المعدية (بروماستيجوتيس ميتاسيكليك أو amastigotes) الليشمانيا والتحديد الكمي عدد الطفيليات داخل الخلايا في كل فاصل زمني 24 ساعة لمدة 72-96 ساعة بعد الإصابة. وقد استخدمت هذا التحليل في المختبر لتحديد تأثير عدد من العوامل البيئية والجينات الطفيلي، بما في ذلك تحديد الدور الحاسم للحديد في النهوض بضراوة أمازونينسيس L. كذلك التحقق من صحتها قبل قاطع الدراسات الإنمائية الآفة في الفئران6،،من89،10،11،،من1213،14،15 . منذ إنشاء جميع أنواع الليشمانيا المسببة للأمراض مكانها replicative داخل الضامة المضيف، يمكن استخدام هذا التحليل عالمياً لقرارات الفوعة في جميع الأنواع الليشمانيا .
أداء التهابات بم يسمح تحليل تفاعلات الطفيلي المضيف على مستوى الخلية الواحدة، وبالتالي فهم أكثر شمولاً لكيفية تفاعل طفيليات الليشمانيا مع بهم المكروية المضيف المفضل، PVs الضامة. استخدمت بلعم فحوصات الإصابة بنجاح قبل عدة مجموعات16،17،18،19،20،،من2122 لاستكشاف وظائف بلعم المضيف و ليشمانيا جينات محددة، ومشاركتها المحتملة في التفاعل المعقد الذي يميز العدوى داخل الخلايا. التهابات بم تسمح للتقدير الكمي لنمو الطفيلي كقراءة تأثير العوامل المضيفة التي تؤثر على البقاء داخل الخلايا، مثل إنتاج أكسيد النيتريك المبيدة وتوليد الأنواع الأكسجين التفاعلية وغيرها من الظروف المعاكسة واجه داخل PVs يحلول تشبه23. كما استخدمت بلعم فحوصات الإصابة لتحديد إمكانية اللايشماني مكافحة المخدرات يؤدي للتنمية العلاجية13،24.
طبيعة الإصابات بم في المختبر يوفر العديد من المزايا عبر طرق أخرى لتقييم ليشمانيا ضراوة. ومع ذلك، العديد من الدراسات السابقة دراسة آليات لبقاء الطفيليات داخل الخلايا مع مرور الوقت لا كمياً الإصابة بمعدل20،،من2124. وعلاوة على ذلك، العديد من الدراسات التي تركز على أثر الإصابات في فيفو على مر الزمن فعلت ذلك بقياس حجم الآفة الجلدية والأعراض الفسيولوجية الأخرى التي تتصل بشكل غير مباشر فقط الطفيلي النسخ المتماثل25،26 , 27-العدوى في فيفو نهجاً صارمة لتقييم الفوعة الطفيلي، ولكن قياسات حجم الآفة استناداً إلى قاطع تورم وحدها غالباً ما تكون غير كافية، كما أنها تعكس استجابة التهاب في الأنسجة المصابة ولا العدد المطلق للطفيليات. ولهذا السبب، قاطع الآفة التنمية فحوصات يجب أن يكون متبوعاً التحديد الكمي للتحميل الطفيلي في الأنسجة المصابة، وهو إجراء يتطلب إضعاف الحد مطولة فحوصات28. بالإضافة إلى ذلك، دراسات في فيفو غالباً ما تنطوي على التضحية بالحيوانات متعددة في نقاط مختلفة في الوقت المناسب لانتزاع الأنسجة لفائدة6،،من89،10، 11 , 13-على النقيض من ذلك، يمكن الحصول على إعداد كبيرة من بنغلادش من الحيوان واحدة فقط، ويمكن أن يكون مطلي بهذه الخلايا في ظل الظروف التي تسمح بتقييم الإصابة في نقاط مختلفة في الوقت المناسب. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع دراسات في فيفو ، أداء في المختبر العدوى بم يسمح سيطرة أكبر على الظروف التجريبية. التحديد الكمي الضامة تصاب جنبا إلى جنب مع الطفيليات نفسها يتيح مراقبة دقيقة لتعدد العدوى (وزارة الداخلية) وشروط الثقافة. يمكن التحكم الجيد في هذه العوامل الرئيسية في تحديد الخصائص للمسارات الخلوية المنفصلة وفهم تأثيرها على مسار العدوى.
ونظرا لهذه المزايا، فمن الدهشة أن مجموعات قليلة جداً دراسة الفوعة ليشمانيا اتخذت حتى الآن الاستفادة الكاملة من التقييم الكمي للنسخ المتماثل داخل الخلايا في الضامة. في هذه المقالة، نحن نناقش المزالق الشائعة التي قد تعوق استخدام أوسع نطاقا لهذا الفحص، ويوفر بروتوكول خطوة بخطوة لتسهيل التنفيذ السليم. النظر دقة وبراعة، المقايسة الإصابة بم يصف لنا هنا يمكن ليس فقط استخدامها لاستكشاف التفاعلات المضيف الممرض التأثير ليشمانيا الفوعة، ولكن أيضا لدراسة الكائنات المجهرية الأخرى التي النسخ المتماثل داخل الضامة29. الأهم من ذلك، يمكن أيضا تطوير هذا الفحص كأسلوب فحص السريري قبل سريعة واقتصادية للتنمية اللايشماني مكافحة المخدرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
البيانات الكمية المنتجة بفحص الإصابة بم الموصوفة أعلاه، يسمح للمحققين الحصول على معدلات الإصابة وتحديد التغيرات في خصائص الفوعة موثوق بها في فترة زمنية قصيرة نسبيا (الحد الأقصى 2 أسابيع، مقارنة إلى 2 أشهر المطلوبة لإجراء تجارب عليها في فيفو ). ويعتمد هذا الأسلوب على صبغ الحمض النووي م…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منحة RO1 AI067979 نوا.
يك هو المتلقي للزمالات الجامعية من هوارد هيوز الطبي معهد/جامعة “ماريلاند كوليدج بارك”.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
Referências
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
