Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania

La leishmaniose se réfère à un large éventail de maladies humaines causées par les espèces de protozoaire parasite du genre Leishmania. Environ 12 millions de personnes sont actuellement infectées par Leishmania dans le monde entier, et plus de 350 millions sont menacés. La pathologie de la maladie dépend de l’espèce de Leishmania et facteurs de l’hôte, et symptômes varient d’innofensif auto guérison des lésions cutanées aux formes visceralizing mortelles. Si non traitée, viscérale de la leishmaniose est fatale, rang seulement après le paludisme comme la plus meurtrière maladie humaine causée par une infection par un protozoaire parasite¹. En dépit des différences de grande envergure dans la pathologie de la maladie et les symptômes, toutes les espèces de Leishmania ont un cycle de digéniques alternant entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et les hôtes vertébrés, respectivement. Intérieur vertébrés, Leishmania ciblent les macrophages hôtes pour invasion et induisent la formation de vacuoles parasitophore (PVs), compartiments acides avec les propriétés des phagolysosomes où les formes hautement virulente amastigote répliquent. Amastigotes persistent dans les tissus de l’hôte lors d’infections chroniques et peuvent être passés vers des phlébotomes, complétant le cycle de transmission. Par conséquent, dans le contexte du développement de la maladie humaine, amastigotes sont le plus important Leishmania lifecycle formulaire². Étudier comment les amastigotes se reproduire à l’intérieur de macrophages PVs est essentiel pour comprendre Leishmania virulence^3,4,5,6,7 et la développement de nouveaux traitements efficaces.

Nous décrivons ici une méthode régulièrement utilisée par notre laboratoire pour étudier les maladies infectieuses Leishmania et réplication dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs), qui prévoit une évaluation quantitative du nombre d’intracellulaire Leishmania au fil du temps. Le processus implique la récolte des monocytes de moelle osseuse de souris et de la différenciation à macrophages en culture, in vitro l’infection avec des formes infectantes (promastigotes métacycliques ou amastigotes) de Leishmania et quantification de la nombre de parasites intracellulaires à chaque intervalle de 24h pour une période de 72-96 h après l’infection. Ce test a été utilisé dans notre laboratoire pour déterminer l’effet de plusieurs facteurs environnementaux et les gènes parasites, y compris l’identification du rôle crucial de fer dans la promotion de L. amazonensis virulence qui a été également validé par coussinet plantaire études de développement de lésions en souris^{6,8,9,10,11,12,13,14,15} . Étant donné que toutes les espèces de Leishmania pathogènes établissent leur niche réplicative à l’intérieur de macrophages de l’hôte, ce test peut être utilisé universellement pour les déterminations de la virulence chez toutes les espèces de Leishmania .

Effectuant des infections BMM permet l’analyse des interactions hôte-parasite au niveau de la cellule unique et donc une plus vaste compréhension de comment les parasites Leishmania interagissent avec leur microenvironnement hôte préféré, le PVs des macrophages. Macrophage infection dosages ont été utilisées avec succès par plusieurs groupes^{16,17,18,19,20,21,22} à explorer fonctions de macrophage hôte et Leishmania de gènes spécifiques et leur implication potentielle dans les interactions complexes qui caractérise l’infection intracellulaire. Les infections BMM permettent la quantification de la croissance du parasite comme une lecture de l’impact des facteurs de l’hôte qui influencent la survie intracellulaire, tels que la production d’oxyde nitrique microbicide, génération d’espèces réactives de l’oxygène et autres conditions défavorables rencontrés dans le lysosome type PVs²³. Macrophage infection essais ont également été utilisés pour identifier prospects de drogue anti-leishmanies potentiels pour le développement de thérapeutiques^13,24.

Le caractère in vitro des infections BMM offre plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes pour évaluer la virulence de Leishmania . Cependant, plusieurs études antérieures, examen des mécanismes de survie du parasite intracellulaire au fil du temps n’ont pas quantifié l’infection comme un taux de^21,20,24. En outre, beaucoup d’études axé sur le suivi des infections in vivo au fil du temps l’a fait en mesurant la taille des lésions cutanées et autres symptômes physiologiques qui ne sont qu’indirectement liées au parasite réplication^{25,26 , 27}. in vivo de l’infection est une approche rigoureuse pour évaluer la virulence du parasite, mais les mesures de taille de lésion basées sur coussinet plantaire gonflement seul sont souvent insuffisantes, car elles reflètent la réponse inflammatoire dans les tissus infectés et pas la nombre absolu de parasites. Pour cette raison, le développement des lésions coussinet plantaire dosages doivent être suivies par la quantification de la charge parasitaire dans les tissus infectés, une procédure qui exige la dilution limite longue tests²⁸. En outre, des études in vivo impliquent souvent sacrifier plusieurs animaux à différents points dans le temps pour en extraire des tissus d’intérêt^{6,8,9,10, 11 , 13}. en revanche, un grand nombre de BMMs peut être obtenu d’un seul animal, et que ces cellules peuvent être plaqués dans des conditions qui permettent l’évaluation d’infection à divers points dans le temps. En outre, par rapport aux études in vivo , effectuant des infections in vitro BMM permet une plus grande maîtrise des conditions expérimentales. Quantifier les macrophages infectés ainsi que les parasites permet un contrôle précis de la multiplicité d’infection (MOI) et des conditions de culture. Contrôle précis sur ces facteurs peut être la clé dans l’identification des caractéristiques des voies cellulaires discrets et dans la compréhension de leur impact sur l’évolution de l’infection.

Compte tenu de ces avantages, il est quelque peu surprenant que très peu étudient des Leishmania virulence ont jusqu’à présent pleinement tiré profit de l’évaluation quantitative de réplication intracellulaire dans les macrophages. Dans cet article, nous discutons des pièges communs qui peuvent être gênant l’utilisation plus étendue de ce test et fournir un protocole étape par étape pour faciliter son application correcte. Compte tenu de sa précision et la polyvalence, le dosage d’infection BMM que nous décrivons ici peut non seulement servir d’explorer les interactions hôte-pathogène qui influent sur la virulence de la leishmaniose , mais aussi d’étudier d’autres microorganismes qui reproduisent à l’intérieur macrophages²⁹. Ce qui est important, ce dosage peut également être développé comme une méthode de dépistage pré-clinique rapide et économique pour le développement de médicaments anti-leishmanies.