Summary

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

Published: March 16, 2018
doi:

Summary

Alle Pathogene Leishmania -Arten befinden sich und innen Makrophagen ihrer Wirbeltier Wirte zu replizieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur murine Knochenmark stammenden Makrophagen in der Kultur mit Leishmanien, gefolgt von präzise Quantifizierung der intrazellulären Wachstum Kinetik zu infizieren. Diese Methode eignet sich für das Studium der einzelnen Faktoren, die die Wirt-Pathogen Interaktionen und Leishmaniose Virulenz.

Abstract

Der Lebenszyklus der Leishmaniose, die Erreger der Leishmaniose, wechselt zwischen Promastigote und Amastigote Phasen innerhalb der Insekten und Wirbeltiere Gastgeber, beziehungsweise. Während Pathogene Symptome der Leishmaniose stark und von gutartigen Hautveränderungen sehr tödliche Krankheit viszeralen Formen abhängig von der infektiösen Sorte variieren können befinden sich alle Leishmania -Arten im Host Makrophagen in der vertebrate Phase des Ihren gesamten Lebenszyklus hinweg. Leishmaniose Infektiosität bezieht sich daher direkt auf seine Fähigkeit, einzudringen, überleben und replizieren innerhalb Parasitophorous Vakuolen (PVs) in Makrophagen. Beurteilung der Parasit Fähigkeit, intrazellulär zu replizieren dient als zuverlässige Methode zur Bestimmung der Virulenz. Leishmaniose-Entwicklung mit Tiermodellen zu studieren ist zeitraubend, mühsam und oft schwierig, vor allem mit den pathogenetisch wichtigen viszeralen Formen. Wir beschreiben hier eine Methode um die intrazelluläre Entwicklung der Leishmaniose im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) folgen. Intrazellulären Parasiten Zahlen werden in 24 h-Intervallen für 72-96 h nach Infektion bestimmt. Diese Methode ermöglicht eine zuverlässige Bestimmung der Auswirkungen von verschiedenen genetischen Faktoren auf Leishmaniose Virulenz. Als Beispiel zeigen wir, wie eine einzelne Allel Löschung des Leishmaniose mitochondriale Eisen-Transporter-Gens (LMIT1) beeinträchtigt die Fähigkeit der Leishmaniose Amazonensis Mutante LMIT1/ΔLmit1 , innen BMMs wachsen, eine drastische Reduzierung der widerspiegelt Virulenz im Vergleich zu Wildtyp. Dieser Test ermöglicht auch präzise Kontrolle der experimentellen Bedingungen, die einzeln bearbeitet werden können, um den Einfluss verschiedener Faktoren (Nährstoffe, reaktive Sauerstoffspezies, etc.) auf die Wirt-Pathogen Interaktionen zu analysieren. Daher bieten die geeignete Ausführung und Quantifizierung der BMM Infektion Studien eine nicht-invasive, schnelle, wirtschaftliche, sichere und zuverlässige Alternative zu herkömmlichen Tiermodell Studien.

Introduction

Leishmaniose bezieht sich auf ein breites Spektrum von menschlichen Krankheiten, die durch einzelliger Parasit Arten der Gattung Leishmaniaverursacht. Etwa 12 Millionen Menschen sind derzeit mit Leishmanien weltweit infiziert, und mehr als 350 Millionen sind gefährdet. Die Pathologie der Krankheit hängt von Leishmania -Arten und Host Faktoren und Symptome variieren von harmlosen selbstheilende Hautläsionen zu tödlichen visceralizing Formen. Wenn unbehandelt, viszerale Leishmaniose tödlich ist, Ranking erst nach Malaria als die tödlichsten Krankheiten verursacht durch eine Infektion mit ein einzelliger Parasit-1. Trotz der vielfältigen Unterschiede in Krankheit Pathologie und Symptome haben alle Leishmania -Arten einen Digene Lebenszyklus Promastigote und Amastigote Phasen innen Insekten und Wirbeltiere Gastgeber jeweils abwechselnd. Innen Wirbeltiere, Leishmaniose Ziel Host Makrophagen für Invasion und induzieren die Bildung von Parasitophorous Vakuolen (PVs), saure Kompartimente mit Eigenschaften von Phagolysosomes wo die hoch virulenten Amastigote Formen replizieren. Amastigoten bestehen in Host Gewebe bei chronischen Infektionen und können weitergegeben werden vorwärts, nicht infizierten Sandmücken, Abschluss des Getriebe-Zyklus. Daher sind im Kontext der Entwicklung der menschlichen Krankheit, Amastigoten die wichtigsten Leishmaniose Lifecycle Form2. Untersuchen, wie die Amastigoten innen Makrophagen PVs repliziert ist von entscheidender Bedeutung für Verständnis Leishmaniose Virulenz3,4,5,6,7 und die Entwicklung neuartiger wirksame Therapien.

Wir beschreiben hier eine Methode, die regelmäßig von unserem Labor verwendet, um studieren Leishmaniose Infektion und Replikation im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs), die quantitative Bewertung der Anzahl der intrazellulären Leishmaniose im Laufe der Zeit beinhaltet. Der Prozess umfasst das Ernten von Monozyten aus Maus Knochenmark und Differenzierung zu Makrophagen in der Kultur, in-vitro- Infektion mit infektiösen Formen (metacyclic Promastigotes oder Amastigoten) von Leishmaniose und Quantifizierung der Anzahl der intrazellulären Parasiten an alle 24 h-Intervall für einen Zeitraum von 72-96 h nach Infektion. Dieser Test wurde in unserem Labor verwendet, um ermitteln die Auswirkungen von mehreren Umweltfaktoren und Parasiten Gene, einschließlich Ermittlung der kritischen Rolle des Eisens bei der Förderung von L. Amazonensis Virulenz, die weiter von Straßenräuber validiert wurde Läsion Entwicklungsstudien in Mäusen6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Da alle Pathogene Leishmania -Arten ihre replikativen Nische innen Makrophagen Host herstellen, kann dieser Assay universell für Virulenz Bestimmungen in allen Leishmania -Arten verwendet werden.

Durchführung von BMM Infektionen ermöglicht Analyse der Wirt-Parasit-Interaktionen auf der Ebene der einzelnen Zelle und damit eine umfassendere Verständnis der Interaktion von Leishmania -Parasiten und ihre bevorzugten Host Mikroumgebung, PVs von Makrophagen. Makrophagen-Infektion-Assays sind durch mehrere Gruppen16,17,18,19,20,21,22 erfolgreich benutzt worden, um zu erkunden Funktionen der Host Makrophagen und Leishmaniose spezifischer Gene, und ihre mögliche Einbindung in das komplexe Zusammenspiel, das intrazelluläre Infektion charakterisiert. BMM Infektionen erlauben Quantifizierung der Parasit Wachstum als eine Auslesung der Auswirkungen der Host Faktoren, die intrazelluläre überleben, wie mikrobizider Stickoxid-Produktion, Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies und andere nachteiligen Bedingungen beeinflussen im Inneren der Lysosomen-wie PVs23begegnet. Makrophagen Infektion Assays wurden auch genutzt, um Anti-Leishmanial Droge Interessenten für therapeutische Entwicklung13,24zu identifizieren.

Die in-vitro- Natur BMM Infektionen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden Leishmaniose Virulenz zu beurteilen. Jedoch mehrere frühere Studien, die Mechanismen der intrazellulären Parasiten überleben im Laufe der Zeit nicht quantifizieren Infektion als ein Satz20,21,24. Darüber hinaus Tat viele Studien konzentriert sich auf folgende in-Vivo -Infektionen im Laufe der Zeit dies durch die Messung der Größe der kutanen Läsion und andere physiologische Symptome, die nur indirekt auf Parasiten Replikation25,26 , 27. in-Vivo -Infektion ist einen stringenten Ansatz Parasit Virulenz zu beurteilen, aber Läsion Größenmessungen Straßenräuber Schwellung allein anhand sind oft unzureichend, da sie die Entzündungsreaktion im infizierten Gewebe widerspiegeln und nicht die absolute Anzahl der Parasiten. Aus diesem Grund Straßenräuber Läsion Entwicklung haben Assays mit anschließendem Quantifizierung der Parasit Last im infizierten Gewebe Proben eine Prozedur, die langwierige begrenzende Verdünnung erfordert28. Darüber hinaus werden in Vivo Studien häufig mehrere Tiere an verschiedenen Punkten in der Zeit von Interesse6,8,9,10, Gewebe zu extrahieren zu Opfern 11 , 13. dagegen zahlreicher BMMs kann nur ein Tier entnommen werden, und diese Zellen können unter Bedingungen, die an verschiedenen Punkten in der Zeit der Infektion bewerten überzogen werden. Darüber hinaus erlaubt im Vergleich zu in-Vivo -Studien, in-vitro- BMM Infektionen mehr Kontrolle über die experimentellen Bedingungen. Quantifizierung der Makrophagen, zusammen mit dem Parasiten selbst angesteckt zu werden, ermöglicht präzise Kontrolle über die Multiplizität der Infektion (MOI) und der Kulturbedingungen. Genaue Kontrolle über diese Faktoren kann Schlüssel Merkmale der diskreten zelluläre Signalwege zu identifizieren und ihre Auswirkungen auf den Verlauf der Infektion zu verstehen sein.

Angesichts dieser Vorteile, ist es wenig verwunderlich, dass sehr wenige Gruppen studieren Leishmaniose Virulenz bisher voll quantitative Bewertung der intrazelluläre Replikation in Makrophagen ausgenutzt haben. In diesem Artikel besprechen wir häufige Probleme, die möglicherweise behindern die weitergehende Nutzung des Assays, und bieten eine schrittweise Protokoll um seine korrekte Umsetzung zu erleichtern. In Anbetracht seiner Präzision und Vielseitigkeit kann der BMM-Infektion-Assay, die, den wir hier beschreiben, nicht nur genutzt werden, Wirt-Pathogen Interaktionen beeinflussen Leishmaniose Virulenz zu erkunden, sondern auch andere Mikroorganismen zu studieren, die im Inneren zu replizieren Makrophagen29. Wichtig ist, kann dieser Test auch als eine schnelle und kostengünstige prä-klinischen Screening-Methode für die Medikamentenentwicklung Anti-Leishmanial entwickelt werden.

Protocol

Alle experimentelle Verfahren wurden von den National Institutes of Health im Einklang mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der University of Maryland IACUC angenommen wurden. Alle Schritte in den Abschnitten 1 bis 4 beschriebenen werden aseptisch in biologischen Laminar-Flow Schränken durchgeführt. Persönliche Schutzausrüstung sollte verwendet werden, und Vorsicht bei der Handhabung der live Leishmania -Parasiten in allen Phasen des Exper…

Representative Results

Leishmaniose hat zwei infektiöse Formen – metacyclic Promastigotes, die an die stationäre Phase der Kultur von prozyklischen Promastigotes unterscheiden und Amastigoten, die den intrazellulären Stadien (Abbildung 1) sind. Bei einigen Leishmania -Arten wie L. Amazonensiskönnen Amastigoten auch in der axenic Kultur unterschieden werden durch die Verlagerung der Promastigote Zellen, um die niedrigeren pH-Wert (4.5) und erhöhter Te…

Discussion

Die quantitative Daten von der BMM Infektion Test oben beschrieben, ermöglicht Ermittler Infektionsraten und eine zuverlässige Bestimmung der Veränderungen der Virulenzeigenschaften in einem relativ kürzeren Zeitraum (maximal 2 Wochen, im Vergleich zu den 2 zu erhalten Monate für in Vivo Experimente erforderlich). Diese Methode beruht auf der DNA-spezifischen Farbstoff DAPI, speziell Flecken Makrophagen und Parasiten Kernen und ermöglicht schnelle Identifizierung und Quantifizierung der infizierten Zellen….

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grant RO1 AI067979 NWA unterstützt.
YK ist Bachelor Fellow der Howard Hughes Medical Institute/University of Maryland, College Park.

Materials

6 well cell culture plate Cellstar 657160
Adenine Acros Organics AC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) Fisherbrand 02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) Fisherbrand 02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) Fisherbrand 02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 Aspen Surgical 371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe Becton Dickinson (BD) 309604
BD Precisionglide Needle, 25G  Becton Dickinson (BD) 305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm Cellstar 627 160
Cell Culture Flask Cellstar 660175
Cover Glasses: 12 mm circles Fisherbrand 12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
D-Biotin J.T. Baker C272-00
EDTA Sigma Aldrich EDS
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco-AAPER 111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish Corning 351029
Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500
Ficoll400 Sigma Aldrich F8016
Fluorescence Microscope Nikon E200
Goat anti-mouse IgG Texas red Invitrogen T-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 Invitrogen A-11034
Hemin Tokyo Chemical Industry Co. LTD H0008
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Isoton II Diluent Beckman Coulter 8546719
L-Glutamine Gemini 400-106
Medium 199 (10X) Gibco 11825-015
Na pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-) ThermoFisher 14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL Cellstar 188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL Cellstar 227 261
ProLong Gold antifade reagent ThermoFisher P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4B
Recombinant Human M-CSF PeproTech 300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer  Hausser Scientific 1492
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Triton X-100 Surfactant Millipore Sigma TX1568-1
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154
Delicate Scissors, 4 1/2" VWR 82027-582
Dissecting Forceps, Fine Tip VWR 82027-386
Microscope Slides VWR 16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold Beckman Coulter 6605699

Referências

  1. WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
  2. Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
  3. Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
  4. Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
  5. Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
  6. Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
  7. Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
  8. Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
  9. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  10. Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
  11. Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
  12. Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
  13. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
  14. Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
  15. Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
  16. McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
  17. Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
  18. Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
  19. Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
  20. Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
  21. Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
  22. da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
  23. Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
  24. Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
  25. Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
  26. Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
  27. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
  28. Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
  29. Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
  30. Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
  31. Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
  32. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
  33. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
  34. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
  35. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  36. Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
  37. Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
  38. Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
  39. Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
  40. Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
  41. Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
  42. Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
  43. Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
  44. McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
  45. Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
  46. Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
  47. Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
  48. Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
  49. Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).

Play Video

Citar este artigo
Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (133), e57486, doi:10.3791/57486 (2018).

View Video