Summary

Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania

Published: March 16, 2018
doi:

Summary

Toutes les espèces pathogènes de Leishmania résident et répliquent à l’intérieur de macrophages de leurs hôtes vertébrés. Nous présentons ici un protocole pour infecter les macrophages dérivés de la moelle osseuse souris dans la culture avec la Leishmania, suivie d’une quantification précise de la cinétique de croissance intracellulaire. Cette méthode est utile pour l’étude des facteurs individuels qui influencent l’interaction hôte-pathogène et la virulence de Leishmania .

Abstract

Le cycle de vie de Leishmania, l’agent causal de la leishmaniose, alterne entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et vertébrés hôtes, respectivement. Alors que les symptômes pathogènes de la leishmaniose peuvent varier considérablement, de lésions cutanées bénignes aux formes hautement mortelle maladie viscérale selon l’espèce infectieux, toutes les espèces de Leishmania résident à l’intérieur de macrophages de l’hôte pendant l’étape de vertébrés du leur cycle de vie. Leishmania infectiosité est donc directement liée à sa capacité à envahir, de survivre et de répliquer dans les vacuoles parasitophore (PVs) à l’intérieur des macrophages. Ainsi, évaluer la capacité du parasite à répliquer intracellulairement sert une méthode fiable pour déterminer la virulence. Étudier le développement de la leishmaniose à l’aide de modèles animaux est long, fastidieux et souvent difficile, en particulier avec les formes viscérales rôle importants. Nous décrivons ici une méthodologie pour suivre le développement intracellulaire de Leishmania dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs). Nombre de parasites intracellulaires est déterminés à intervalles de 24 h pour 72-96 h après l’infection. Cette méthode permet une détermination fiable des effets de divers facteurs génétiques sur la virulence de Leishmania . À titre d’exemple, nous montrons comment une délétion seul allèle du gène Mitochondrial transporteur de fer Leishmania (LMIT1) porte atteinte à la capacité de la souche mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 à pousser à l’intérieur de BMMs, soit une réduction drastique dans la virulence par rapport au type sauvage. Ce dosage permet également un contrôle précis des conditions expérimentales, qui peuvent être manipulés individuellement pour analyser l’influence de divers facteurs (nutriments, espèces réactives de l’oxygène, etc.) sur l’interaction hôte-pathogène. Par conséquent, l’exécution appropriée et la quantification des études d’infection BMM fournissent une alternative non invasive, rapide, économique, sécuritaire et fiable pour les études sur des modèles animaux conventionnels.

Introduction

La leishmaniose se réfère à un large éventail de maladies humaines causées par les espèces de protozoaire parasite du genre Leishmania. Environ 12 millions de personnes sont actuellement infectées par Leishmania dans le monde entier, et plus de 350 millions sont menacés. La pathologie de la maladie dépend de l’espèce de Leishmania et facteurs de l’hôte, et symptômes varient d’innofensif auto guérison des lésions cutanées aux formes visceralizing mortelles. Si non traitée, viscérale de la leishmaniose est fatale, rang seulement après le paludisme comme la plus meurtrière maladie humaine causée par une infection par un protozoaire parasite1. En dépit des différences de grande envergure dans la pathologie de la maladie et les symptômes, toutes les espèces de Leishmania ont un cycle de digéniques alternant entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et les hôtes vertébrés, respectivement. Intérieur vertébrés, Leishmania ciblent les macrophages hôtes pour invasion et induisent la formation de vacuoles parasitophore (PVs), compartiments acides avec les propriétés des phagolysosomes où les formes hautement virulente amastigote répliquent. Amastigotes persistent dans les tissus de l’hôte lors d’infections chroniques et peuvent être passés vers des phlébotomes, complétant le cycle de transmission. Par conséquent, dans le contexte du développement de la maladie humaine, amastigotes sont le plus important Leishmania lifecycle formulaire2. Étudier comment les amastigotes se reproduire à l’intérieur de macrophages PVs est essentiel pour comprendre Leishmania virulence3,4,5,6,7 et la développement de nouveaux traitements efficaces.

Nous décrivons ici une méthode régulièrement utilisée par notre laboratoire pour étudier les maladies infectieuses Leishmania et réplication dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs), qui prévoit une évaluation quantitative du nombre d’intracellulaire Leishmania au fil du temps. Le processus implique la récolte des monocytes de moelle osseuse de souris et de la différenciation à macrophages en culture, in vitro l’infection avec des formes infectantes (promastigotes métacycliques ou amastigotes) de Leishmania et quantification de la nombre de parasites intracellulaires à chaque intervalle de 24h pour une période de 72-96 h après l’infection. Ce test a été utilisé dans notre laboratoire pour déterminer l’effet de plusieurs facteurs environnementaux et les gènes parasites, y compris l’identification du rôle crucial de fer dans la promotion de L. amazonensis virulence qui a été également validé par coussinet plantaire études de développement de lésions en souris6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Étant donné que toutes les espèces de Leishmania pathogènes établissent leur niche réplicative à l’intérieur de macrophages de l’hôte, ce test peut être utilisé universellement pour les déterminations de la virulence chez toutes les espèces de Leishmania .

Effectuant des infections BMM permet l’analyse des interactions hôte-parasite au niveau de la cellule unique et donc une plus vaste compréhension de comment les parasites Leishmania interagissent avec leur microenvironnement hôte préféré, le PVs des macrophages. Macrophage infection dosages ont été utilisées avec succès par plusieurs groupes16,17,18,19,20,21,22 à explorer fonctions de macrophage hôte et Leishmania de gènes spécifiques et leur implication potentielle dans les interactions complexes qui caractérise l’infection intracellulaire. Les infections BMM permettent la quantification de la croissance du parasite comme une lecture de l’impact des facteurs de l’hôte qui influencent la survie intracellulaire, tels que la production d’oxyde nitrique microbicide, génération d’espèces réactives de l’oxygène et autres conditions défavorables rencontrés dans le lysosome type PVs23. Macrophage infection essais ont également été utilisés pour identifier prospects de drogue anti-leishmanies potentiels pour le développement de thérapeutiques13,24.

Le caractère in vitro des infections BMM offre plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes pour évaluer la virulence de Leishmania . Cependant, plusieurs études antérieures, examen des mécanismes de survie du parasite intracellulaire au fil du temps n’ont pas quantifié l’infection comme un taux de21,20,24. En outre, beaucoup d’études axé sur le suivi des infections in vivo au fil du temps l’a fait en mesurant la taille des lésions cutanées et autres symptômes physiologiques qui ne sont qu’indirectement liées au parasite réplication25,26 , 27. in vivo de l’infection est une approche rigoureuse pour évaluer la virulence du parasite, mais les mesures de taille de lésion basées sur coussinet plantaire gonflement seul sont souvent insuffisantes, car elles reflètent la réponse inflammatoire dans les tissus infectés et pas la nombre absolu de parasites. Pour cette raison, le développement des lésions coussinet plantaire dosages doivent être suivies par la quantification de la charge parasitaire dans les tissus infectés, une procédure qui exige la dilution limite longue tests28. En outre, des études in vivo impliquent souvent sacrifier plusieurs animaux à différents points dans le temps pour en extraire des tissus d’intérêt6,8,9,10, 11 , 13. en revanche, un grand nombre de BMMs peut être obtenu d’un seul animal, et que ces cellules peuvent être plaqués dans des conditions qui permettent l’évaluation d’infection à divers points dans le temps. En outre, par rapport aux études in vivo , effectuant des infections in vitro BMM permet une plus grande maîtrise des conditions expérimentales. Quantifier les macrophages infectés ainsi que les parasites permet un contrôle précis de la multiplicité d’infection (MOI) et des conditions de culture. Contrôle précis sur ces facteurs peut être la clé dans l’identification des caractéristiques des voies cellulaires discrets et dans la compréhension de leur impact sur l’évolution de l’infection.

Compte tenu de ces avantages, il est quelque peu surprenant que très peu étudient des Leishmania virulence ont jusqu’à présent pleinement tiré profit de l’évaluation quantitative de réplication intracellulaire dans les macrophages. Dans cet article, nous discutons des pièges communs qui peuvent être gênant l’utilisation plus étendue de ce test et fournir un protocole étape par étape pour faciliter son application correcte. Compte tenu de sa précision et la polyvalence, le dosage d’infection BMM que nous décrivons ici peut non seulement servir d’explorer les interactions hôte-pathogène qui influent sur la virulence de la leishmaniose , mais aussi d’étudier d’autres microorganismes qui reproduisent à l’intérieur macrophages29. Ce qui est important, ce dosage peut également être développé comme une méthode de dépistage pré-clinique rapide et économique pour le développement de médicaments anti-leishmanies.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux recommandations du guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire par le National Institutes of Health et ont été approuvés par l’Université du Maryland IACUC. Toutes les étapes décrites dans les sections 1 à 4 devraient être effectués aseptiquement à l’intérieur des hottes à flux laminaire biologique. Protection individuelle doit être utilisée, et il faut être prudent lors de la manipulation de Leishmania …

Representative Results

Leishmania a deux formes infectantes – promastigotes métacycliques qui différencient des promastigotes procycliques à la phase stationnaire de la culture et les amastigotes, qui sont les stades intracellulaires (Figure 1). Chez certaines espèces de Leishmania comme L. amazonensis, amastigotes peuvent également être différenciés en culture axénique en déplaçant les cellules promastigote pour abaisser le pH (4.5) et des tem…

Discussion

Les données quantitatives produites par l’essai d’infection BMM décrit ci-dessus, permet aux enquêteurs d’obtenir des taux d’infection et une détermination fiable des changements dans les propriétés de virulence dans un laps de temps relativement court (maximum 2 semaines, par rapport à la 2 mois nécessaires pour des expériences in vivo ). Cette méthode s’appuie sur le colorant spécifique de l’ADN DAPI, qui précisément les taches noyaux macrophage et parasite et permet une identification…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de la subvention RO1 AI067979 de la santé à RNF.
YK est récipiendaire de la bourse de premier cycle de l’Howard Hughes Medical Institute de l’Université du Maryland à College Park.

Materials

6 well cell culture plate Cellstar 657160
Adenine Acros Organics AC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) Fisherbrand 02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) Fisherbrand 02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) Fisherbrand 02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 Aspen Surgical 371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe Becton Dickinson (BD) 309604
BD Precisionglide Needle, 25G  Becton Dickinson (BD) 305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm Cellstar 627 160
Cell Culture Flask Cellstar 660175
Cover Glasses: 12 mm circles Fisherbrand 12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
D-Biotin J.T. Baker C272-00
EDTA Sigma Aldrich EDS
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco-AAPER 111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish Corning 351029
Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500
Ficoll400 Sigma Aldrich F8016
Fluorescence Microscope Nikon E200
Goat anti-mouse IgG Texas red Invitrogen T-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 Invitrogen A-11034
Hemin Tokyo Chemical Industry Co. LTD H0008
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Isoton II Diluent Beckman Coulter 8546719
L-Glutamine Gemini 400-106
Medium 199 (10X) Gibco 11825-015
Na pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-) ThermoFisher 14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL Cellstar 188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL Cellstar 227 261
ProLong Gold antifade reagent ThermoFisher P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4B
Recombinant Human M-CSF PeproTech 300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer  Hausser Scientific 1492
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Triton X-100 Surfactant Millipore Sigma TX1568-1
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154
Delicate Scissors, 4 1/2" VWR 82027-582
Dissecting Forceps, Fine Tip VWR 82027-386
Microscope Slides VWR 16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold Beckman Coulter 6605699

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Citar este artigo
Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (133), e57486, doi:10.3791/57486 (2018).

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