Användning av Anti-phospho-girdin antikroppar att visualisera Intestinal tofs celler i friflytande mus Jejunum kryosnitt

Alla metoderna som beskrivs här godkändes av djur vård och användning kommittén av Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center (ansökningsnummer: M-03). 1. förberedelser Förbereda 10 L fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS): 32.27 g Na2HPO4·12H2O, 4,5 g NaH2PO4·2H2O, 80,0 g NaCl tillsätts med ultrarent vatten till en slutlig volym 10 L. Store lösning vid rumstemperatur (RT). Förbereda 200 mL PBS-T: 200 mL PBS från steg 1,1 med 100 µL av polyoxyethylene(10) octylphenyl eter till en slutlig koncentration på 0,05% (VOL:VOL)(2)). Butiken på RT. Samtidigt bär skyddshandskar och ögonskydd, förbereda 50 mL 15% sackaros i 10% buffrad neutral formalin lösning: 7,5 g sackaros tillsättas 10% buffrad neutral formalin lösning (Tabell för material) till en slutlig volym 50 ml. Butiken på RT.FÖRSIKTIGHET: Inandning och/eller hud/ögon kontakt med formaldehyd i 10% buffrad neutral formalin lösning kan vara farligt. Hanteras med försiktighet. Förbereda 1,5 mL 200 enheter/mL phalloidin fluorescerande färgämne konjugat stamlösning: phalloidin fluorescerande färgämne konjugat (300 enheter i 1 injektionsflaska, frystorkade solids, excitering och utsläpp våglängder: 581 nm och 609 nm, respektive) upphängd i 1,5 mL metanol. Förvaras i mörker vid-20 ° C. Förbereda 5 mg / mL 4′, 6-diamidin-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI) stamlösning: DAPI 10 mg i 2 mL av N, N-dimetylformamid (DMF). Förvaras i mörker vid-20 ° C. Förbereda 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS: 0,5 g BSA, 10 mL PBS. Förvaras vid 4 ° C. Ta bort den avfasade spetsen av en 18 gauge rak nål med en tång, och nyp nipped slutet med en pincher i längsgående riktning till tillåter vätska att flöda genom nållumenet (figur 1A1).Obs: Protokollet kan pausas här. 2. djurens dissektion och isolering av Jejunum Perfusion fixering av en mus Använd handskar och arbeta i ett väl ventilerat utrymme. Förbereda en 100 mL-glasbägare, 10% buffrad neutral formalin lösning, kirurgiska verktyg (saxar, pincetter), en metallisk bricka, 6-0 nylon skär suturer, en 18 gauge rak nål tillagad som 1,7, 22 gauge bevingade nål, en 20 mL-spruta. Fyll 20 mL 10% buffrad neutral formalin lösning från glasbägaren i 20 mL sprutan och hur nålen 22 gauge bevingade utlopp. Förbereda flytande gelatin genom att lägga till 1 g gelatin pulver 20 mL PBS (sista 5% gelatin) i ett 50 mL centrifugrör. Efter blötläggning på RT i 15 min, inkubera vid 50 ° C i ett vattenbad i 15 min utan att skaka. Kort vortex, och inkubera vid 50 ° C för en annan 15 min till lös upp gelatinet. Lämna röret på RT fram till användning. Avliva en vuxen mus av cervikal dislokation. Placera musen från steg 2.1.6 på en metallisk bricka och göra ett litet snitt på huden genom ensiform brosk med kirurgiska verktyg. Expandera snitt med båda händerna att exponera regionerna bröstkorg och buk. Öppna bukhinnan för att exponera membranet, och öppna sedan membranet på båda sidor. Skär bröstkorg buren i främre axillär linje på båda sidor, sedan ta bort bröstkorgens vägg genom att skära i en tvärgående riktning vid position av tymus att exponera hjärtat. Gör ett litet snitt på hjärtörat av höger förmak dränera blodet och infoga en 22 gauge bevingade nål i spetsen av vänster kammare. Tryck kolven att BEGJUTA vävnader med 10% buffrad neutral formalin lösning. Efter utsätta organ i bäckenet, avskurna i slutet av ändtarmen från anus och separera tarmarna från kroppen genom att skära krös. För att isolera jejunum, skär tarmarna vid 4 cm från anal sida av den gastric antrum. Kassera den anal hälften av återstående tunntarmen. Klipp av jejunum på mitten för att underlätta spolning förfarandet. Lasten 20 mL 10% buffrad neutral formalin lösning i 20 mL sprutan och hur nålen 18 gauge raka bereddes i steg 1,7 till utlopp. Injicera 10% buffrad neutral formalin lösning från ena änden av den klippta jejunum att spola ut tarminnehållet och fixar gut lumen ytan (figur 1A2). Tvätta gut lumen genom att injicera PBS som beskrivs i steg 2.1.15. Spola flytande gelatin i gut lumen som beskrivs i steg 2.1.15 att ersätta PBS med flytande gelatin. Nära ena änden av den klippta jejunum av suturen ligering med en 6-0 nylon skär sutur, fylla i jejunum med flytande gelatin och Stäng den motsatta änden av suturen ligatur (figur 1A3). Lägga till fyra suturen knop för att passa en korv-formade jejunum avsnitt till deprimerad-delen av en cryomold (figur 1A4).Obs: För cryomolds med en 20 mm x 25 mm x 5 mm deprimerad avsnitt, ett ~ 20 mm korv-liknande jejunum avsnitt är att föredra. Blötlägg vävnader i 50 mL 15% sackaros i 10% buffrad neutral formalin lösning över natten vid 4 ° C.Anmärkning: Se stegen till cryoprotection av sackaros och protein fixering av formalin av gelatin och vävnad. Formalin-gelatinized gelatin smälter inte vid RT, medan icke-fasta gelatinized gelatin vid 4 ° C smälter vid RT. 3. Fäst frysning av Gelatin-fyllda Jejunum vävnader Genom att minska jejunum på suturen knutar, erhålls tre korv-liknande jejunum bitar med båda ändarna sammanskrivna (figur 1A4). Justera korv-liknande bitar i en cryomold för tillägg av inbäddning förening för beredning av djupfrysta vävnadsprover. Snapin frysa cryomold i isopentan kyls med flytande kväve. Store cryomolds vid-80 ° CObs: Protokollet kan pausas här. 4. immunofluorescens av tofs celler använder friflytande kryosnitt Kryosnitt Ställ in både kryostaten kammartemperatur (CT) och objektet temperatur (OT) till-22 ° C. Plats fryst vävnad blockera i en cryomold i kryostatkammaren för minst 15 min. Tillsätt 3 mL PBS till en 35 mm kultur maträtt. Ta bort blocket fryst vävnad från cryomold och skär blocket i halv med ett rakblad att exponera den tvärgående delen av jejunum. Montera en halv block på en chuck (en kryostaten adapter) avsnitt det skärande planet med rakbladet. Avsnitt i gelatin-fyllda jejunum i 30 µm tjocka sektioner. Använda frysta pincett försiktigt överföra avsnitten i 35-mm kultur skålen bereddes i steg 4.1.2 (figur 2Bhöger). Tillämpningen av primära antikroppar Tvätta friflytande avsnitten i 35-mm kultur skålen 3 gånger för 5 min varje med 3 mL PBS-T med milda skakningar på en ömsesidig skakapparat (ungefärligt 36 gånger / min). Förbereda antigen retrieval lösning: 0,3 mL antigen retrieval lösning koncentrat (Tabell för material) i 2,7 mL av ultrarent vatten. Lägga till 3 mL antigen retrieval lösning till 35 mm kultur skålen som innehåller fritt flytande sektioner. Stäng locket, täta gapet mellan skålen och locket med en remsa av vinyltejp och inkubera vid 50 ° C i en hybridisering inkubator för 3 h utan att skaka. Ta bort skålen från inkubator och cool på RT i 20 min. Efter avlägsnande av vinyltejp, tvätta avsnitten 3 gånger för 5 min varje med 3 mL i PBS-T och milda skakningar. Aspirera PBS-T och tillsätt 5 droppar blockerande lösning (Tabell för material) på avsnitten. Inkubera vid RT i 5 min med milda skakningar. Bered den primär antikropp: 495 µL av 5% BSA i PBS med 5 µL av phospho-Y1798 girdin (pY1798) antikroppar (Tabell för material). Tillsätt 500 µL av primär antikropp lösning på avsnitten (blockerande lösningen inte behöver tas bort). Placera skålen i en fuktad inkubation kammare och inkubera över natten vid 4 ° C med milda skakningar.Obs: Den natten inkubationen kan utökas till upp till tre nätter. Tillämpningen av sekundära antikroppar Tvätta avsnitten 3 gånger för 5 min varje i 3 mL i PBS-T med milda skakningar. Förbereda utspädda DAPI stamlösning: 2 µL av DAPI stamlösning (steg 1,5), 998 µL av PBS. Sekundära antikroppar lösning: 476 µL av 5% BSA i PBS, 10,5 µL utspädda DAPI lösningen, 12,5 µL av phalloidin fluorescerande färgämne konjugat stamlösning, 1 µL get anti-kanin IgG-fluorescerande färgämne konjugat (våglängd: excitation 496 nm, emission 520 nm). Efter aspirering av PBS-T, tillämpas den sekundära antikroppar lösningen och inkubera i en ljus-skärmad inkubation kammare vid RT för 30 min med milda skakningar. Tvätta avsnitten 3 gånger för 5 min varje med 3 mL i PBS-T och milda skakningar. Efter den sista tvättningen, ta den PBS-T och ersätta med 3 mL PBS saknar polyoxyethylene(10) octylphenyl eter. Överföra skålen till en stereoskopisk Mikroskop. Plats 200 µL av PBS i en droplet på mitten av ett MAS-belagd vitt glas bild och överföra en jejunum avsnitt från skålen till droplet-programmet använder ett P200 Pipettera tips. Efter justering avsnitt justeringen i stereoskopisk Mikroskop, aspirera alla återstående PBS kring avsnittet. Tillsätt 20 µL av vattenhaltigt montering media och placera ett 20 x 20 mm täckglas ovanpå media. Omedelbart försegla täckglas kanterna med xylen-baserade montering media. Placera bilden på en trä mappe och låt xylen-baserade montering media att stelna på RT för 2-3 h.Obs: Protokollet kan pausas här. Efter xylen-baserade montering media stelnar, kan bilder lagras i 2-3 veckor i en ljus-skärmad bild låda på RT. 5. konfokalmikroskopi Pålagda 63 X syftet confocal Mikroskop nedsänkning olja. Sänk täckglas-bilden och placera bilden på scenen. Digitalisera TC bilderna förvärvat vid laser våglängderna 405, 488 och 555 nm och spara bilder i tiff-format (TIFF).Obs: Välj en upptäckt filter som är lämplig för fluorescens färgämnen (dvs excitation/utsläpp maxima: 358/461 nm, 490/525 och 590/617).