استخدام الأجسام المضادة-والرمات-جيردين لتصور الخلايا خصل المعوية في الماوس التعويم الحر صائم كريوسيكشنز
Summary
كوجا et al. اكتشف أن الفسفرة-وضع أجسام مضادة محددة ضد جيردين بروتين الأكتين ملزمة فوسفوريلاتيد في تيروزين 1798 (pY1798) يمكن استخدامها لتسمية الخلايا خصل (TCs). يسمح هذا البروتوكول التصور قوية من اللجان الفنية باستخدام صبغة إيمونوفلوريسسينت من التعويم الحر صائم كريوسيكشنز مع الأجسام المضادة pY1798.
Abstract
جيردين بروتين الأكتين ملزم هو بروتين سيتوسوليك ما مطلوب الأكتين يعيد البناء لتحريك الهجرة الخلية في الأنسجة المختلفة. جيردين هو فوسفوريلاتيد كل من مستقبلات وغير مستقبلات تيروسين مؤنزم في تيروزين 1798. Omori et al. تطوير الموقع والفسفره الخاصة بوضع أجسام مضادة ضد جيردين البشرية في تيروزين-1798 (pY1798)، التي تلزم على وجه التحديد إلى 1798 تيروزين فوسفوريلاتيد ولكن ليس على أونفوسفوريلاتيد تيروزين-1798. pY1798 الأجسام المضادة قد استخدمت لتسمية على وجه التحديد خلايا خصل (TCs) الموجودة في أنسجة الثدييات في الجهاز الهضمي، ولكن وظيفة هذه الخلايا غير واضحة. ويسمح هذا البروتوكول التصور قوية من اللجان الفنية في صائم استخدام الأجسام المضادة pY1798 والفلورة. إلى ضمان التصور TC ناجحة وبسيطة، يشتمل هذا البروتوكول على تقنيات نسيجية هما: إنتاج كريوسيكشنز التعويم الحر من أنسجة مليئة بالجيلاتين صائم، واسترجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة عند 50 درجة مئوية حاء 3 ملء الصائم مع الجيلاتين يحافظ على شكل مقاطع التعويم الحر طوال فترة الإجراءات المصبوغة، بينما يضمن استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة إشارات قوية من نتائج الاستخدام الناجح لهذا البروتوكول في تلطيخ pY1798 من TCs الموزعة من الزوائد تلميح إلى اللجان الفنية. سرداب. TCs الملون من سوما على شكل التخزين المؤقت، وإشارات الفلورسنت تتكثف في تلميح لومينال، الذي يتوافق مع بارزة ‘خصل’. تلوين فالويدين كولوكاليزيد مع TCs pY1798 إيجابية على الحدود فرشاة سميكة، ويتوافق مع كتلة روتليت تمتد من خصل TC. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة TCs في عينات خزعة البشرية مع المناظير الجهاز الهضمي. وعلاوة على ذلك، TCs مؤخرا أفيد أن تتراكم بعد الإصابة بالطفيليات في الفئران، مما يوحي بأن هذا البروتوكول قد يكون لها تطبيقات لتشخيص العدوى بالطفيليات في الأمعاء البشرية.
Introduction
الخلايا خصل (TCs) عناصر متفرقة طفيفة في ابيثيليا المعوية التي تتميز بها تافتس قمي واتفاقات على شكل التخزين المؤقت1. على الرغم من أن اللجان الفنية وصفت أولاً في عام 19562، يظل من غير الواضح، جزئيا بسبب الافتقار إلى موثوقية TC علامات الدالة TC.
انوموتو et al. أولاً يتميز البروتين ملزمة أكتين جيردين3، التي يعبر عنها في الجهاز العصبي، وكذلك في الأنسجة غير العصبية مثل الأوعية الدموية، صمامات القلب، والاوتار، والهيكل العظمى والعضلات4. عرض الفئران مع الاجتثاث الوراثية من جيردين تأخر النمو والدماغ متعددة الشذوذ4،،من56. وفي الوقت نفسه، طفرة الخسارة من الدالة في جيردين البشرية يرتبط مع الاكسجة التدريجي، والتخلف العقلي الشديد، وبداية ظهور نوبات الصرع7.
في عام 2011، حدد لين et al. الفسفرة دينامية من جيردين في تيروزين 1798 توسط تيروسين مؤنزم مثل EGFR و Src8. كما أظهرت أن جيردين فوسفوريلاتيد مطلوب لإعادة عرض أكتين لتحريك الخلية الهجرة8. Omori et al. تطوير الموقع–والفسفره الخاصة بمركز أضداد جيردين البشرية فوسفوريلاتيد في تيروزين 1798 (الأجسام المضادة pY1798) بعد البروتوكول للانتقال إلى، والتحقق من صحتها الأضداد استخدام الطفرات موقع الموجه من التعبير ناقلات تحمل كامل طول جيردين9،10. في عام 2017، كوجا et al. وذكرت أن pY1798 تسميات TCs مع خصوصية عالية وحساسية عالية1. وعرضت الأجسام المضادة pY1798 لتكون متفوقة على علامات TC السابق استناداً إلى خصائص المصبوغة الممتازة التي كشفت شكل خلية كاملة، بما في ذلك السمة ‘خصل’ في تلميح لومينال، بعد دور البيولوجية جيردين وجيردين والرمات في TC وظلت وظيفة غير واضحة1.
الأسلوب الموصوفة في هذه الدراسة تشمل الفلورة تلطيخ، تقنية النسيجي بمناسبة بروتين محددة في الأنسجة استخدام جسم الأولية ضد بروتين المستهدف وجسم ثانوي مترافق fluorescence ضد المرحلة الابتدائية الأجسام المضادة. والغرض من هذا الأسلوب للسماح للباحثين بمحدودية الخبرة النسيجي للحصول على صور ذات جودة عالية TC. هذا البروتوكول يستخدم التعويم الحر كريوسيكشنز التي تجنب الحاجة إلى كريوسيكشنز محمولة على الشريحة، أو البارافين القسم. ولكن المقاطع التعويم الحر هشا بسبب غياب الدعم من شريحة زجاجية وسمك الفرع يمكن أن يقلل من نفاذية جسم. يتضمن هذا البروتوكول بين النهجين أن التغلب على هذه القضايا: 1) ملء التجويف صائم كامل مع الجيلاتين للحفاظ على مورفولوجية أقسام التعويم الحر طوال الإجراءات المصبوغة، و 2) استخدام استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة إلى تكثيف الإشارات pY1798.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول للسماح للباحثين دون تجربة علم الأنسجة الحصول على صور موثوقة للخلايا خصل (TCs). هذا البروتوكول له ثلاث نقاط حرجة: 1) استخدام الموقع-والفسفره الأرانب الخاصة بمركز [بولكلونل] أجسام ضد البشرية جيردين فوسفوريلاتيد في تيروزين 1798 (الأجسام المضادة pY1798) التي تم الحصول عليها من (شركة محددة مختبرات إيمونوبيولوجيكال = الشركة X)؛ 2) الجيلاتين بملء الصائم؛ و 3) استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة. في أوسع معانيه، يمكن تصنيف الأجسام المضادة الخاصة بمركز الفسفرة كالأجسام المضادة الخاصة بالتعديل أن يتعرف على نوع معين من تعديل بوستترانسلاشونال (مثل أسيتيليشن أو مثلايشن الفسفرة) من البروتين في رواسب معينة من الأحماض الأمينية. Omori et al. وولدت الشركة س معا pY1798 الأجسام المضادة بتحصين الأرانب مع الببتيد فوسفوريلاتيد، وتنقية الأجسام المضادة الناتجة عن استخدام كروماتوغرافيا المرحلة الصلبة مع ببتيد أونفوسفوريلاتيد بعد للانتقال إلى أسلوب9، 10-pY1798 الأجسام المضادة تم التحقق من صحة مكثف مع فحوصات الفسفرة في المختبر باستخدام ناقلات التعبير جيردين البشرية كاملة الطول مع/بدون طفرة نقطة في تيروزين 17989. وفي وقت لاحق، وجد كوجا et al. أن الأجسام المضادة pY1798 من الشركة س علامة معينة وحساسة من الأمعاء TCs1. وهكذا، إدراج الأجسام المضادة pY1798 من الشركة س نقطة حرجة في هذا البروتوكول.
الجيلاتين يحتوي على الكولاجين المستخرجة من الأنسجة الحيوانية، ومنذ فترة طويلة تستخدم لتضمين عينات الأنسجة للدراسات histochemical باستخدام كريوسيكشنز13. نقطة انصهار منخفضة الجيلاتين، الذي هو مهيلم عند 4 درجة مئوية ولكن يذوب في درجة حرارة الغرفة، بدأ تطبيقها لتجنب الآثار الضارة للحرارة اللازمة للحفاظ على الجيلاتين في حالة سائلة أثناء تضمين14. في هذا البروتوكول، استخدمت الجيلاتين نقطة انصهار منخفضة مصنوعة من مسحوق الجيلاتين التي جيلاتينيزيس عند 4 درجة مئوية ويذوب في RT للحفاظ على مورفولوجية كريوسيكشنز عرضية من صائم الماوس. عندما تستخدم هذا الجيلاتين لملء تماما الصائم، عينات ثم الفورمالين-ثابتة لتحقيق جيلاتينيزيشن لا رجعة فيه. استرجاع الحرارة المستحثة مستضد هو طريقة فعالة للكشف عن المستضدات التي يتم حجب المصفف المحتوية على ألدهيد12. ومع ذلك، يمكن أن تلحق الضرر درجات حرارة عالية (95-99 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) استخداماً لتحليل مقاطع البارافين مورفولوجية معقدة الأنسجة/الجيلاتين. هنا استخدمنا استرجاع مستضد درجة حرارة منخفضة (50 درجة مئوية، ح 3) الذي يسمح باسترجاع مستضد والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة.
يمكن تسمية الأجسام المضادة pY1798 TCs في الماوس صائم، بل أيضا في الأجهزة متعددة (المعدة واللفائفي والقولون والمرارة) من الفئران والبشر1. ومع ذلك، نظراً لسرعة سوف تتحلل إشارات pY1798 في أنسجة غير المثبتة من أي أنسجة، يتضمن هذا البروتوكول حقن الفورمالين في التجويف صائم (الخطوة 2.1.15.، 1A الشكل2).
وهناك القيود المرتبطة بسمك كريوسيكشنز التعويم الحر. على الرغم من أن كريوسيكشنز رقيقة يمكن أن يكون مفيداً من حيث الشفافية للفحص المجهري، ركاكة يجعل هذه الأقسام الضعيفة ماديا. وفي المقابل، كريوسيكشنز سميكة قوي جسديا، لكن يكون أقل جسم النفاذية في القسم. واستخدمت في هذا البروتوكول، 30 ميكرون سميكة المقاطع التي كانت مستقرة ماديا وإنفاذاً للأجسام المضادة. على الرغم من أن هذا الأسلوب قد صمم للباحثين دون خبرة واسعة في علم الأنسجة، إذا كان البروتوكول يجب أن تفشل، pY1798/بيلين/DAPI تلطيخ ثلاثية من البارافين أقسام مماثلة لتلك المستخدمة من قبل كوجا et al. يمكن أن يؤديها1. مقاطع البارافين لم تستخدم هنا لتجنب الصعوبات المرتبطة تلطيخ فالويدين من أكتين و في مقاطع البارافين.
بسبب المحافظة على سلاسل الأحماض الأمينية المتاخمة جيردين تيروزين-1798، pY1798 الأجسام المضادة يمكن تطبيقها على وصمة عار TCs في الأنواع عدا الماوس، بما في ذلك الفئران والإنسان. يمكن أيضا تطبيق شغل الجيلاتين المستخدمة في هذا البروتوكول للأجهزة الأخرى جوفاء. وفي الواقع، وبصرف النظر عن pY1798 أو TC، مزيج الجيلاتين ملء مع درجة حرارة منخفضة مستضد استرجاع قد تكون مفيدة للكشف عن المعروف “صعب” [ابيتوبس] في القناة الهضمية الماوس، ونتيجة لذلك، قد تكون ذات أهمية بالنسبة لكثير من الباحثين.
من غير الواضح دور البيولوجية جيردين وأهمية عن الفسفرة في اللجان الفنية. ومع ذلك، دراسة أجراها لين et al. واقترح أن التيروزين الفسفرة من جيردين يرتبط بدرجة بلمرة الأكتين و8. وفي الوقت نفسه، وجد كوجا et al. أن قاتلة جرعات من مستحثات المبرمج (مثلاً.، سيسبلاتين، إشعاع الأشعة السينية) أدى إلى زيادة كبيرة في التواتر النسبي للجان الفنية في الأمعاء الماوس التي افترض أنها قد تكون مرتبطة ممكن التحويل من انتيروسيتيس إلى اللجان الفنية، بالتزامن مع الفسفرة من جيردين في زغيبات1. وسيتطلب هذا الإمكانية التحقيق إضافية في المستقبل. ثلاث مجموعات لاحظ مؤخرا السريع زيادة في تواتر TC عقب الطفيلي العدوى15،،من1617. وهكذا، هذا تلطيخ التعويم الحر يمكن استخدامها ليس فقط لتحليل الأنسجة التي تم جمعها اندوسكوبيكالي في القناة الهضمية البشرية، ولكن تراكم TC يمكن أن تساعد أيضا في تشخيص الإصابة بالطفيليات في الأمعاء البشرية.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر أساي ناويا في جامعة ناغويا لتقديم اقتراحات مفيدة لتطوير استرجاع مستضد درجات الحرارة المنخفضة للتعويم الحر صائم المقاطع. تم دعم هذا العمل من معونة ل Scientific Research (KAKENHI) (C) في 2012 (JP25460493) و (ب) في عام 2017 (JP17H04065) من “الجمعية اليابانية” لتعزيز العلوم (JSPS)، يمنح A-خطوة في عام 2014 (AS251Z02522Q) وفي عام 2015 (AS262Z00715Q) من اليابانية للعلوم والتكنولوجيا وكالة (JST)، والبصيرة وتاكيدا البحوث 2014 منحة من مؤسسة العلوم تأكيدا (للماجستير).
Materials
| Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
| Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
| Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
| Sucrose | Wako | 190-00013 | |
| 10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
| Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
| 18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
| 22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
| Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
| Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
| Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
| Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
| Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
| Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
| Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
| Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
| Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
| Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
| Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
| Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |
Referências
- Kuga, D., et al. Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut. J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).
- Jarvi, O., Keyrilainen, O. On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren. Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).
- Enomoto, A., et al. Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE. Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).
- Asai, M., et al. Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage. Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).
- Kitamura, T., et al. Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin. Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).
- Wang, Y., et al. Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain. J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).
- Nahorski, M. S., et al. CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse. Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).
- Lin, C., et al. Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration. Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).
- Omori, K., et al. Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration. Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).
- Goto, H., Inagaki, M. Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody. Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue. J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).
- Ushida, K. Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections. Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
