Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Proteasas regulan procesos fisiológicos por unirse a las proteínas, y el inicio de la actividad de la proteasa en momentos concretos y lugares es regulada¹. Por lo tanto es importante identificar la expresión y actividad de los tejidos que están reguladas localmente y para desarrollar un nuevo método para detectar las proteasas. El método propuesto en este estudio tiene como objetivo identificar la especificidad de la proteasa en paralelo a la detección de las proteasas.

Existen algunos métodos para detectar la especificidad de la proteasa. El método de azocasein es bien sabido para su uso en la detección de las proteasas² pero está limitado en su capacidad para obtener más información. Zymography es otro método de detección integral de proteasa que puede utilizarse para determinar el peso molecular de proteasas³, pero no puede utilizarse para examinar la especificidad de sustrato. Especificidad de la proteasa puede determinarse por análisis espectrométricos, utilizando sustratos como la p-nitroanilida⁴y los análisis fluorométrico, usando cumarina sustratos⁵ o de ensayos de transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET)⁶. Estos métodos permiten detección única especificidad de sustratos contenidos en un solo pozo. En el presente estudio, la especificidad de la proteasa de extractos de tejido se examina bajo diversas condiciones, ya que estos extractos contienen proteasas múltiples. Actividad de las proteasas es regulada por varios factores, incluyendo fuerza del ion, pH, coenzimas y grupos prostéticos. Recientemente, se han utilizado métodos basados en proteómica para identificar la especificidad de la proteasa; por ejemplo, el método reportado por Biniossek et al. ⁷ el proteoma se utiliza para determinar la especificidad de sustrato incluso en extractos crudos y permite la determinación exacta de la actividad de la hendidura de las proteasas que reconocen múltiples secuencias de aminoácidos⁸. Sin embargo, este método no es adecuado para el análisis de numerosas muestras. En cambio, nuestro método permite el procesamiento simultáneo de múltiples muestras y el uso de mediante desorción/ionización del Laser (MALDI-TOF) de tiempo de vuelo espectrometría de masas para el análisis de la muestra facilita la detección rápida y fácil de la hendida sustratos.

Este documento describe un método para evaluar la especificidad de la proteasa utilizando espectrometría de masas MALDI-TOF para medir el peso molecular de sustratos únicos. Las formas moleculares de sustratos troceados, junto con su peso molecular teórico, se muestran en la figura 1 y tabla 1. Estudios previos han utilizado substratos que contienen separadores de polyglycine y biotina⁹; sin embargo, estos sustratos son defectuosas porque la secuencia de polyglycine puede ser troceada por enzimas que reconocen la secuencia de la glicina. Además, la alta afinidad entre la avidina y la biotina puede conducir a una tasa de recuperación bajo. Para mejorar estos inconvenientes, en este estudio que sintetizaron un sustrato único, que fue compuesto de polietilenglicol (PEG), iminobiotin y un aminoácido que puede identificar el sitio de la hendidura (figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso molecular similar, D-serina fue agregado entre el espaciador PEG y el aminoácido en el sitio exfoliado.

El N-terminal del sustrato fue etiquetado con iminobiotin, que permite la purificación de la afinidad de muestras de crudo. El uso de iminobiotin en lugar de biotina es crítico; la biotina tiene una fuerte afinidad con la avidina, que se traduce en las tasas de baja recuperación de sustratos marcados con biotina de la resina de la avidina, mientras que la afinidad de iminobiotin de avidina puede ser alterado por pH. Sustratos marcados Iminobiotin se unirán a avidina en condiciones por encima de pH 9, mientras que la avidina libera sustratos marcados con iminobiotin en condiciones por debajo de pH 4. Por lo tanto, iminobiotin fue utilizado para la purificación de afinidad¹⁰. En Resumen, se describe un protocolo detallado para detectar la especificidad de proteasa utilizando sustratos únicos.