마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작
Summary
여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.
Abstract
프로 테아 제 단백질 활성화/비활성화 및 음식 소화를 포함 하 여 여러 생물 학적 기능을가지고. 효소 특이성을 식별 하는 것이 효소 기능을 공개에 대 한 중요 합니다. 이 연구에서 제안 된 메서드는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 결정 합니다 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석. 기판 포함 iminobiotin, 쪼개진된 사이트 구성 아미노산, 그리고는 스페이서 이루어져 있다 폴 리 에틸렌 글리콜. 쪼개진된 기판 독특한 분자량 쪼개진된 아미노산을 사용 하 여 생성 됩니다. 이 방법의 장점 중 하나입니다 그것은 원유 샘플을 사용 하 여 한 냄비에 실행 될 수 있습니다 그리고 그것은 또한 여러 샘플을 평가 적합. 이 문서에서는, 우리는 마우스 폐 조직, 조직 추출, 소화 기판의에 배치 샘플, 다른 pH 조건 하에서 소화 기판의 정화 등에서 추출 하는 샘플으로 최적화 하는 간단한 실험 방법 설명 및 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 기판의 분자량의 측정. 요약 하자면,이 기술은 여러 샘플 처리에 대 한 쉽게 확장 될 수 있습니다 하는 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성의 식별에 대 한 수 있습니다.
Introduction
프로 테아 제, 단백질 절단형에 의해 생리 적 프로세스 조절 그리고 특정 시간과 장소에서 효소 활동의 개시는 규제1. 그러므로 식 및 로컬 규제, 조직의 활동을 식별 하 고 프로 테아 제를 감지 하는 새로운 방법을 개발 하는 것이 중요 하다. 에 제안 된 방법은이 연구 프로 테아 제를 감지 하는 동시에 효소 특이성을 식별 하는 것을 목표로.
효소 특이성을 탐지 하기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. Azocasein 메서드는 프로 테아 제2 의 검출에 사용을 위해 유명 하다 그러나 추가 정보를 얻을 하는 능력에 제한 된다. Zymography 프로 테아 제3의 분자량을 결정 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 종합 효소 검출 방식 이지만 기질 특이성을 검사 하는 데 사용할 수 없습니다. 효소 특이성 spectrometric 분석, 기판 p-nitroanilide4, 등을 사용 하 여 및 fluorometric 분석 실험, coumarin 기판5 또는 형광 공명 에너지 전송 (무서 워) 분석 실험6을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 이 메서드는 단일 잘에서 포함 하는 기판의 단일 특이성 탐지를 사용. 현재 연구에서 이러한 추출 물 포함 여러 프로 테아 제 효소 특이성 조직 추출의 다양 한 조건에서 검사 합니다. 효소 활동은 pH, 코엔자임, prosthetic 그룹, 이온 강도 등 여러 가지 요인에 의해 통제 된다. 최근, proteomics 기반 방법 효소 특이성;을 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 예를 들어, Biniossek 외에서 보고 하는 방법. 7 조 추출 물에도 기질 특이성을 결정 하는 프로테옴을 사용 하 고 여러 아미노산 시퀀스8을 인식 하는 프로 테아의 분열 활동의 정확한 결심을 허용 한다. 그러나,이 메서드는 수많은 샘플의 분석에 적합 하지. 우리의 메서드 여러 샘플의 동시 처리 및 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화의 사용을 사용 하는 반면, 시간의 비행 (TOF MALDI)는 쪼개진의 신속 하 고 쉽게 감지 샘플 분석을 위한 질량 분석에 용이 하 게 기판입니다.
이 종이 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 그들의 이론적 분자 무게, 함께 쪼개진된 기판의 분자 형태는 그림 1 과 표 1에 표시 됩니다. 이전 연구 polyglycine 스페이서 및 biotin9;를 포함 하는 기판 사용 그러나, 이러한 기판 polyglycine 시퀀스 글리신 시퀀스를 인식 하는 효소에 의해 죽 습 있을 수 있습니다 때문에 결함이 있습니다. 또한, avidin 비타민 b 복합체 사이 높은 선호도 낮은 회복 율을 이어질 수 있습니다. 하 우리는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG), iminobiotin, 및 분열 사이트 (그림 1)을 식별할 수 있는 아미노산의 구성 되었다 독특한 기질 합성이 연구에서는 이러한 단점에 향상. 유사한 분자 무게의 아미노산 사이 차별, D-떠들고 못 스페이서 사이 쪼개진된 사이트에서 아미노산 추가 되었습니다.
기판의 N 맨끝 원유 샘플에서 친 화력 정화를 가능 하 게 iminobiotin로 분류 됐다. Biotin 대신 iminobiotin의 사용은 매우 중요; biotin은 avidin, avidin에 대 한 iminobiotin의 선호도 pH에 의해 변경 될 수 있습니다 동안 avidin 수 지에서 biotin 표시 된 기판의 낮은 회수율 결과와 강한 선호도 하고있다. Iminobiotin 표시 된 기판 avidin pH 4 아래 조건에서 기판 iminobiotin 표시를 해제 하는 동안 pH 9, 위의 조건에서 avidin에 바인딩합니다. 따라서, iminobiotin는 친 화력 정화10사용 되었다. 요약, 우리는 독특한 기질을 사용 하 여 효소 특이성을 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성을 식별 하 고 쉽게 여러 샘플 처리에 대 한 조정 될 수 있습니다. 특히, 우리는 기질 특이성에 변화를 일으킬 pH를 조작.
avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 (ABC) 메서드, 생화학의 바인딩 특이성 때문에 널리 이용 되는, 우리의 프로토콜에 이용 되었다. ABC의 강한 선호도, 인해 avidin 비?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일본 제약 대학 (2016)과 문 부 과학성 KAKENHI 보조금 번호 JP17854179에서 일본 제약 대학 연구 보조금에 의해 부분에서 지원 되었다.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Referências
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