Här presenterar vi en metod för en mänsklig in vitro- modell av stretch skada i en 96-väl format på en tidsskala som är relevanta att påverka trauma. Detta inkluderar metoder för att fabricera töjbart plattor, kvantifiera den mekaniska förolämpning, odling och skadar celler, imaging och hög innehållsanalys att kvantifiera skadan.
Traumatisk hjärnskada (TBI) är en klinisk utmaning med hög sjuklighet och dödlighet. Trots decennier av preklinisk forskning, har inga beprövade terapier för TBI utvecklats. Detta dokument presenterar en ny metod för prekliniska neurotrauma forskning avsedda att komplettera befintliga prekliniska modeller. Det introducerar mänskliga patofysiologi med hjälp av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived nervceller (hiPSCNs). Det uppnår lastning puls Spellängd liknar lastning varaktigheterna av kliniska stängd huvudattrapp skada. Det sysselsätter ett 96 brunnar format som underlättar hög genomströmning experiment och gör effektiv användning av dyra celler och kultur reagenser. Silikon membran först behandlas för att ta bort neurotoxiska ohärdat polymer och sedan limmade på kommersiella plattan med 96 brunnar organ att skapa töjbara 96 brunnar. En specialbyggd enhet används att strecksatsen några eller alla av de väl bottnarna från under, förmå equibiaxial mekaniska påfrestningar som mekaniskt skadar celler i kultur i brunnarna. Förhållandet mellan indrag djup och mekaniska belastningen bestäms empiriskt med hög hastighet videography av väl bottnar under indrag. Celler, inklusive hiPSCNs, kan vara odlade på dessa silikon membran använder modifierade versioner av konventionella cell kultur protokoll. Fluorescerande mikroskopiska bilder av cellkulturer förvärvas och analyseras efter skada på ett halvautomatiskt sätt att kvantifiera skadan i varje brunn. Den modell som presenteras är optimerad för hiPSCNs men skulle i teorin kunna tillämpas på andra celltyper.
TBI är en viktig orsak till dödlighet och sjuklighet i Förenta staterna, orsakar cirka 52 000 dödsfall och 275.000 sjukhusinläggningar varje år1. Mer än 30 kliniska prövningar av kandidat therapeutics för TBI har utförts utan ett enda framgång2. Detta enhetliga misslyckande föreslår att mänskliga-specifika processer separat mänskliga TBI från patofysiologin hos vanliga prekliniska djurmodeller.
Tillkomsten av hiPSCNs har skapat en möjlighet att studera neurotrauma i mänskliga in vitro- modell. Drug screening med hiPSCN-baserade modeller kan leverera resultat som är mer prediktiva för klinisk framgång än modeller som sysselsätter gnagare celler. Även kan hiPSCNs vara genetiskt manipulerade för att isolera och studera effekten av enskilda människors genetiska varianter på patologi3.
Den metod som beskrivs i detta manuskript är utformad för att ge de unika fördelarna med hiPSCN-baserade sjukdom modellering till neurotrauma. In vitro stretch skada modeller av neurotrauma är väl etablerad4,5,6 med primära gnagare celler och mänskliga neurala cancer cellinjer. De flesta av dessa modeller generera stretch av pneumatiskt laddar ett silikon membran. Denna metod är effektiv i ett enda väl format men har visat sig svårt att skala upp till flera format7. Som ett resultat, har det aldrig funnits en hög genomströmning skärm för agenter att behandla stretch skadade nervceller.
I denna modell, sträcker sig membranet på grund av indraget från undersidan med en styv indenter. Denna strategi har visat flera gånger att generera kliniskt patologi in vitro- system för enkel väl8,9,10. Vårt senaste arbete har visat att det lätt skalas upp till 96 brunnar format bibehållen puls varaktigheter storleksordningen tiotals millisekunder11, vilket är den tid som domänen för stängd huvudattrapp händelser12,13.
Sammanfattningsvis är de viktigaste fördelarna med denna in vitro- skada modell formatet 96 brunnar, användning av hiPSCNs och kliniskt relevant tidsdomänen för förolämpning.
Nyckeln till att få en konsekvent, biofidelic fenotyp i denna modell är att tillämpa en konsekvent biofidelic mekaniska förolämpning. Denna modell kan generera puls varaktigheter så kort som 10-15 ms, som liknar puls varaktigheterna för människans huvud påverkan enligt avlidna experiment12,13. Konsekvensen av denna förolämpning beror på anpassning av plattan med indenter blocket och konsekvent smörjning av indenters. När indenter blocket är väl anpassad, finns ingen trend i tillämpad stam över rader eller kolumner (figur 2 c). Ett tunt lager smörjmedel skapar vanligtvis mindre friktion än ett tjockt lager och trögflytande fetter rekommenderas inte eftersom de foul silikon och hindrar passage av ljus under mikroskopi. Faktiska scenen deplacement amplituden kan väsentligen når en föreskriven deplacement amplituden när många indenters används, och ordinerade scenen deplacement amplituden är stor (> 3 mm). Medan den faktiska förskjutningen är mindre än den föreskrivna förskjutningen vid stora amplituder, är det dock fortfarande repeterbara (figur 2B). Därför kan stora, riktiga förskjutningar amplituder erhållas på ett tillförlitligt sätt genom att ange ett föreskrivet värde överstiger önskat värde. Deplacement amplitud frågor bara för att det är ett enkelt inspelade proxy för peak membran stam, som direkt mäter den mekaniska förolämpning som inducerar patologi. Det förfarande som beskrivs för att bestämma membran stam från scenen förskjutning är därför kritisk. Denna process bör upprepas om sådant större ändringar i systemet som påverkar samspelet mellan plattan och indenters, till exempel om olika diameter indenters, olika indenter material eller beläggningar eller olika typer av silikon bottnat plattan används. Processen att omforma kvarteret indenter och fastställande av noll ståndpunkt bör upprepas i början av varje experiment. En schematisk bild av stretching enheten visas i figur 1. CAD-modeller som krävs för att återskapa enheten tillhandahålls som kompletterande material: ‘ skada enheten – FULL församling – generiska 3D. STEG ‘; associerad strukturlista som anges somkompletterande Tabell1: Custom byggt enheter – BOM.xlsx. Se även kompletterande tabell 2 96 väl platta _loader – Pinut kablage Diagram.xlsx, som beskriver de kabelanslutningar som ansluter olika komponenter i systemen. ‘Interconnector_circuit_board.dip’ beskriver ett kretskort som sammanbinder kablarna.
Om enheten inaktiveras med scenen i mitten av dess resor, flyttar scenen efter makt är avskuren eftersom det är fjäderbelastade. När strömmen återställs, kommer att feedbackloop upptäcka en stor skillnad mellan den sista kända föreskrivna positionen och den faktiska. Detta kommer att orsaka scenen för att plötsligt flyttas till läget den var i när enheten var inaktiverat. Denna plötsliga rörelsesensor kan orsaka fel i produktionen av kodaren, så försiktighet bör iakttas att avaktivera enheten endast när det i dess unpowered viloställning på toppen av sin resa.
Fabrication klämman är avsedd att sammanföra plattan kropp och silikon botten på ett sätt som tillåter optimal bonding. Därför finns det tre viktiga funktioner i den design som presenteras i den kompletterande filen ‘ Press dö – generiska 3D. STEG ‘. Första är klämman plattan kropp innehavaren parallella längst silikon. Om detta är korrekt byggd, kräver det ingen justering efter den första installationen. Det andra ger lagret av skumgummi i klämman en liten mängd av överensstämmelse under plattan, som ett helt stelt system skulle teoretiskt upplever en plötslig ökning från noll klämkraft till oändlig klämkraft när klämman stängdes. Placeringen av ribban och ställskruv av klämman är justerbara så att avståndet mellan de två sidorna av klämman kan finjusteras.
Alla ansträngningar bör göras att ge en ljus, vit bakgrund bakom pricken längst väl under stam karakterisering experiment. Desto bättre kontrast i dessa bilder, desto lättare blir det att automatisera processen med att mäta höjden och bredden på den punkten, som kan bli tröttsamt för en mänsklig operatör analysera ett stort experiment. Höghastighetståg videography på botten av en brunn i en plattan med 96 brunnar presenterar utmaningar eftersom väggarna i brunnen tenderar att kasta skuggor. Användningen av en kupol ljus eller diffus axiella ljus som kan lysa upp längs siktlinjen till kameran utan att skymma bilden eliminerar skuggor eller speglande reflektioner som skulle uppstå med en konventionell ljuskälla. Ljusaste tillgängliga ljuskällan bör användas eftersom ljusa belysning ger bilder som ska förvärvas med en kort exponeringstid. Korta exponeringstider minimerar rörelseoskärpa. Uppgradering av lysdioder (LEDs) i det diffusa axiella ljuset tillåter kortare exponeringstider under hög hastighet video förvärv. Lysdioderna kan uppgraderas genom att öppna den diffusa axiella ljuset, ta bort beståndet lysdioder, montering 4 high power LED-kedjor till fönstret tillbaka använder lysdioder innehavare, ansluta dem till en konstant nuvarande makt leverans och återmontering det diffusa axiella ljuset (se tabellen Material för katalognummer). Nackdelen med uppgradering lysdioderna är att passivt kylda lysdioderna inte kan hållas mer än ett par sekunder på grund av risken för överhettning. Därför behövs ett annat ljus för uppriktning av justeringen efter block och kamera.
Den presenterade metoden att kvantifiera membran stam genom att mäta utvidgning av en prick som stämplas på membranet är ganska grov, men det kan skala upp till flera brunnar i en robust sätt. Fältet stam över väl botten kan karaktäriseras mer i detalj med hjälp av digital bild korrelation. Denna teknik innebär besprutning en spräcklig mönster på basen av brunnen och sedan imaging den på hög hastighet under deformation. Kommersiell programvara kan sedan användas för att kvantifiera påfrestning vid varje punkt i bilden genom att spåra utvecklingen av spräckliga mönstret.
Detta protokoll ger en mångfacetterad, kliniskt relevant, stretch skada fenotyp i hiPSCNs. Celldöd, neurite degeneration och neurite beading är alla väl dokumenterade följdtillstånd av TBI hos människor och djur modeller15. Nyckeln till framgång i denna modell att upprätta och upprätthålla friska kulturer. Generellt, är en cell kultur protokoll som utvecklats med konventionella stela plattor en värdefull utgångspunkt för töjbart plattan kultur. Möjligheten att cellerna i fråga kan reagera annorlunda på silikon måste dock alltid övervägas. Detta gäller särskilt för hiPSCNs, som är mycket känsliga för odlingsbetingelser. Några exempel på optimera cell densiteten och laminin koncentration levereras i avsnittet Representativa resultat (figur 3, figur 4). Aktivering av silikon med plasmabehandling är avgörande. Silikon är hydrofoba och föga reaktivt; i sitt naturliga tillstånd, kommer det inte binda till laminin eller andra molekyler som används för att främja cell fastsättning. Plasmabehandling återger ytan hydrofil och exponerar reaktiva grupper. Dessa förändringar kan adhesionsmolekyler binda till silikonet och främja cell fastsättning. Det är viktigt att notera att plasma behandlingseffekten avleder inom minuter om inte ytan är nedsänkt i vätskan, och så som involverar torkning aktiverade ytan bör utföras så snabbt som möjligt. Ett enkelt sätt att kontrollera om effekten av plasmabehandling har avklingat är att placera en droppe vatten på ytan. På obehandlade silikon, kommer droplet-programmet bead upp medan på plasma behandlas silikon, det kommer att sprida ut. Med den hiPSCNs som vi använde (se Tabell för material), tillverkaren rekommenderar att lägga till laminin med cellsuspension snarare än före beläggning. Detta protokoll har införlivat denna strategi framgångsrikt. Medan segmentering kan, i teorin, utföras med öppen källkod eller general-purpose programmeringsspråk, krävs en hög grad av yrkeskunnande med dessa verktyg för att få bra resultat. Neuriter är ofta svåra att skilja från bakgrund signal eftersom de är så slanka. Därför rekommenderar vi användning av kommersiell programvaruverktyg distribueras av hög innehåll mikroskopi företag med särskilda moduler för segmentering och kvantifiering av nervceller, om de är tillgängliga. Även med kommersiell programvara är det klokt att exportera bilder av segmentering att visuellt kontrollera riktigheten.
Det finns vissa begränsningar som är associerade med arbetar i töjbart plattor jämfört med konventionella, styva plattor. Töjbart plattor kan avbildas som vanligt med luft mål. Imaging med nedsänkning mål är dock mycket svårt. Lins olja kan skada silikonet. Dessutom utövar målet påtryckningar på silikon membranet rör sig uppåt. Detta tryck förflyttar membranet vertikalt, vilket gör det svårt att få provet i fokus. Silikon membranen som för närvarande används i tillverka plattorna är cirka 250 µm tjock. Denna tjocklek överskrider brännvidd av många hög effekt, nedsänkning mål. Särskild försiktighet måste iakttas att lägga membran perfekt platt innan fastspänning för att uppnå planhet krävs för mikroskopi. Autofokus system kan kompensera för avvikelser i planhet av färdiga plattan i viss utsträckning. Framtida versioner av protokollet kan pre spänning membran innan det är bundna till platta toppen att säkerställa planhet. Lim-fri förfarandet för limning silikon membran till platta topp14 anses vara en viktig styrka av det nuvarande protokollet. Det eliminerar risken för neurotoxicitet från limmet samt eventuella avvikelser i planhet på grund av icke-enhetlig tjocklek på det självhäftande skiktet.
Multi elektrod matriser används ofta i experiment med hiPSCNs för att bedöma deras mognad och funktionalitet. Tyvärr, dessa system är oförenliga med denna modell eftersom cell kultur substratet är styv. Det är möjligt att skapa ett töjbart multi elektrod array, även om detta har hittills endast visats i en enda väl format16,17. Observera att indenters kan tas bort individuellt från indenter blocket så att vissa brunnar inte är indragen och kan fungera som shams. Ta bort indenter förhindrar indrag men eliminerar inte helt mekanisk lastning eftersom det finns fortfarande inertial rörelse av vätskan i brunnarna när scenen är i rörelse. Det är värt att jämföra dessa brunnar brunnar i plattor som aldrig omfattades scenen rörelse att mäta någon patologisk påverkan av flytande rörelse. Utbud av indenters i block bör också vara bisymmetric (symmetrisk från framsidan till baksidan och sida till sida). Denna försiktighetsåtgärd säkerställer att plattan laddas jämnt under indrag, så att scenen inte luta i sidled och orsaka stavar att binda i deras lager.
En av de viktigaste utmaningarna att terapeutiska innovationer i neurotrauma är komplexitet och heterogenitet av villkora. Trauma gäller multimodala stress varje celltyp i centrala nervsystemet samtidigt. Nervceller har genererats tillförlitligt från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och är nu allmänt tillgängliga från kommersiella leverantörer. Innovation fortskrider snabbt i det här fältet och andra typer av neurala celler såsom astrocyter18 och mikroglia19 också som härrör från hiPSCs. Det kan snart vara möjligt att isolera de cell-autonoma svar av varje av dessa celltyper till trauma in vitro- och sedan till samtidig kultur olika celltyper att förstå hur de kommunicerar efter trauma. På detta sätt kan det i slutändan vara möjligt att återskapa den kliniska utmaningen från botten upp grundligt förstå det i en mänsklig system. Detta synsätt skiljer sig från den konventionella metoden att förlita sig på djurmodeller och har potential att generera nya insikter som leder till de första behandlingar för detta gemensamma, förödande och svårbehandlade tillstånd.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds delvis av ett anslag från National Institutes of Health (R21NS098129). Vi skulle vilja erkänna utmärkta tekniskt bistånd från SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng och Feng Yuan Bu, som konstruerade och byggde en struktur för att stödja lampor som används under hög hastighet imaging experiment som beskrivs i detta manuskript .
.010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
(3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
hiPSCNs | Cellular Dynamics International |