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Neurociência

Método para la lesión de estiramiento de alta velocidad de humanos inducida por las neuronas derivadas de células madre pluripotentes en formato de 96 pocillos

Published: April 20, 2018
doi:
10.3791/57305
, , ,
1Department of Neurosurgery,NorthShore University HealthSystem, 2Midwestern University/Chicago College of Osteopathic Medicine, 3Independent Contractor

Summary

Aquí presentamos un método para un modelo humano en vitro de estiramiento lesiones en un formato de 96 pozos en una escala de tiempo pertinente al trauma de impacto. Esto incluye métodos para la fabricación de placas estirables, cuantificar el insulto mecánico, cultivo y lesionar las células, la proyección de imagen y alto contenido análisis para cuantificar daños.

Abstract

Lesión cerebral traumática (TBI) es un desafío clínico importante con alta morbilidad y mortalidad. A pesar de décadas de investigación preclínica, se han desarrollado sin terapias bien comprobadas para la LCT. Este artículo presenta un método novedoso para la investigación de la clínica de neurotrauma previsto complementar los modelos preclínicos existentes. Presenta la fisiopatología humana mediante el uso de neuronas de derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCNs). Alcanza el pulso de carga duración similar a la duración de la carga de clínico cerrado lesiones de impacto principal. Emplea un formato de 96 pozos que facilita los experimentos de alto rendimiento y hace un uso eficiente de las células costosas y reactivos de la cultura. Membranas de silicona son tratadas primero para quitar el polímero neurotóxico y entonces se enlaza a los cuerpos para crear placas de 96 pocillos estirables comercial placa de 96 pocillos. Un dispositivo de medida se utiliza para sangrar algunos o todos los fondos bien desde abajo, induce tensiones mecánicas equibiaxial que lesiona mecánicamente las células en cultivo en los pozos. La relación entre la profundidad de la indentación y la tensión mecánica se determina empíricamente mediante videografía de alta velocidad de fondos bien durante la sangría. Células, incluyendo hiPSCNs, pueden ser cultivadas en estas membranas de silicona usando versiones modificadas de los protocolos de cultivo celular convencional. Imágenes fluorescentes microscópicas de cultivos celulares son adquiridos y analizados después de la lesión de manera semiautomática para cuantificar el nivel de la lesión en cada pozo. El modelo presentado es optimizado para hiPSCNs pero podría en teoría ser aplicado en otros tipos celulares.

Introduction

TBI es una causa importante de mortalidad y morbilidad en los Estados Unidos, causando alrededor de 52.000 muertes y 275.000 hospitalizaciones cada año1. Se han realizado más de 30 ensayos clínicos de la terapéutica del candidato para la LCT sin un solo éxito2. Este fracaso uniforme sugiere que procesos específicos de humanos separan humano TBI la patofisiología observada en modelos de roedores los utilizados.

El advenimiento de hiPSCNs ha creado una oportunidad para estudiar neurotrauma en un modelo humano en vitro . Detección con modelos basados en hiPSCN de drogas pueden ofrecer resultados que son más predictivos de éxito clínico que los modelos que emplean células de roedores. Además, hiPSCNs puede ser manipulado genéticamente para aislar y estudiar el efecto de variantes genéticas humanas individuales en patología3.

El método descrito en este manuscrito está diseñado para llevar las ventajas únicas de la enfermedad de hiPSCN de modelado para neurotrauma. In vitro modelos estiramiento lesiones de neurotrauma son bien establecido4,5,6 con células de roedores primarias y líneas celulares de cáncer humano de nervios. La mayoría de estos modelos genera tramo neumáticamente cargando una membrana de silicona. Este enfoque es efectivo en un único formato bien pero ha resultado difícil a escala hasta un formato multi-bien7. Como resultado, nunca ha sido una pantalla de alto rendimiento para los agentes para el tratamiento de estiramiento las neuronas lesionadas.

En este modelo, la membrana se extiende debido a la sangría de debajo con un penetrador rígido. Este enfoque ha demostrado repetidas veces para generar patología clínicamente relevantes en vitro en sistemas bien solo8,9,10. Nuestro trabajo reciente ha demostrado que fácilmente escala a un formato de 96 pocillos manteniendo duraciones de pulso del orden de decenas de milisegundos11, cual es el tiempo dominio de cerrado principal impacto eventos12,13.

En Resumen, las principales ventajas de este modelo de lesión en vitro son el formato de 96 pozos, el uso de hiPSCNs y el dominio del tiempo clínicamente relevante de la injuria.

Protocol

1. silicona desintoxicación Cortar rectángulos de 7,5 x 11 cm usando una cuchilla de afeitar y una plantilla de acrílico a 254 μm espesor, membranas de silicona 30,48 cm x 30,48 cm. 10 membranas rectangulares pueden realizarse con cada hoja. Guardar el papel que viene con la silicona. Colocar las membranas en una tina de agua desionizada (DI) con jabón de cristalería. Uno a la vez, limpiar las membranas enérgicamente con los dedos enguantados para al menos 20 s o hasta que la espuma. Lavar las membranas con DI agua hasta que el jabón lathered se retira visiblemente. Colocar las membranas en el papel (de su embalaje) y autoclave en un ciclo de gravedad. Remoje cada membrana de silicona de 250 mL de etanol al 70% por la membrana en un agitador orbital a 60 rpm para 24 h. uso un contenedor fabricado de un material que no reacciona con etanol, como el polipropileno. Si más de una membrana se coloca en un recipiente único, o si las membranas se pegan a la parte inferior del recipiente, separar las membranas de su entorno con las puntas de pipeta de plástico y pipeta racks de punta. Transferencia de las membranas de silicona con las manos enguantadas a 250 mL de agua desionizada por membrana y reposen sobre el agitador orbital durante 48 h a 60 rpm. Colocar las membranas en el papel y el lugar en un horno de vidrio de 93 ° C durante 4 h. Almacenar las membranas en el papel, en un lugar limpio y seco, cubierto con otra hoja de papel para protegerlos del polvo. 2. placa fabricación Plasma tratar una tapa de placa de 96 pocillos con un plasma de W 200 limpiador (véase Tabla de materiales) de 60 s de alta potencia, colocación lateral ascendente dentro del plasma limpiador. Busque un resplandor púrpura visible a través de la ventana de la cámara, lo que indica que se ha formado un plasma efectivo. Esta técnica de adhesión es adaptada de Sunkara et al. 14 Dentro de 60 s, en 200 mL de 1,5% (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) en agua desionizada durante 20 minutos, coloque la placa inferior hacia abajo. Esta solución es inestable: prepararlo en no más de 60 s antes de introducir la placa.Atención: Trabajar con APTES en una campana de humos. Plasma tratar una membrana de silicona extraído en el plasma limpiador por 60 s en alta potencia. Tiempo el tratamiento de plasma que termina no más de 5 minutos antes de finalizar el período de 20 minutos en el paso 2.2. Utilice pinzas para colocar la membrana del plasma tratado en la parte superior un rectángulo de papel de 7.5 x 11 cm2 pergamino. Alinee un 7,5 x 11 cm x losa de aluminio de 0,5 cm en la parte inferior de la abrazadera de la fabricación de placa. Alinee el papel de la membrana y pergamino de silicona en la placa de aluminio con unas pinzas.Nota: Archivos de diseño asistido por ordenador (CAD) para este dispositivo son proporcionados en los materiales complementarios como un archivo de código complementario ‘ prensa morir – 3D genérico. PASO ‘. Se suministra la lista asociada de materiales en complementario tabla 1: costumbre construido dispositivos – BOM.xlsx. Retirar las tapas de la placa del baño APTES y sacuda el exceso de solución. Inmersión en un baño de agua de 200 mL DI para 5 s y sacuda el exceso de agua. Inmersión en un baño de agua de 200 mL diferentes DI para 5 s y sacuda el exceso de agua. Vuelva a colocar el agua en estos baños antes de sumergir otra parte superior de la placa. Utilice aire comprimido para secar completamente la parte superior de la placa. Coloque la placa en la parte superior de la abrazadera de la fabricación de placa. Cierre suavemente la abrazadera de fabricación la placa para presionar la parte superior de la placa y silicona juntas. Abrazadera para al menos 1 h. Deje que la plancha curar durante 24 h a temperatura ambiente antes de usar, protegido contra el polvo. 3. estirar una placa de Limpie a los penetradores.Nota: Ver figura 1 complementaria. Preparar un sonicador de baño estilo W 60 con DI agua a temperatura ambiente. Apoyo del bloque de penetrador encima el baño sonicador, invertido de modo que sólo las cimas de los penetradores son sumergidas a una profundidad de al menos 1 mm. someter a ultrasonidos penetradores durante 8 min a 42 kHz. Golpe seco penetradores con aire comprimido. Alinee el bloque de penetrador. Colocar una cámara con un vivo por encima del dispositivo que está mirando hacia abajo en la matriz de penetrador. Se centran en la parte superior de los penetradores.Nota: La configuración descrita en la sección 4, “Caracterización de la membrana Stretch,” es una configuración de la cámara posible para esta tarea. Fijar una placa en el escenario del dispositivo de la lesión con las pinzas de la etapa (figura 1) y colocar una luz sobre el dispositivo.Nota: Consulte la Tabla de materiales para el software de control del instrumento. Ejecute el software de control de instrumento haciendo clic en el icono en el escritorio de la computadora que controla el dispositivo de la lesión. Ejecutar el proyecto “in_vitro_neurotrauma.lvproj” haciendo clic sobre ella en la ventana de lanzamiento. Desde la ventana de proyecto, iniciar el control de movimiento y posición de instrumentos virtuales tracker (VIs), que se denominan ‘motion_control.vi’ y ‘position_tracker.vi’, respectivamente, haciendo doble clic en ellos. Cerca de la jaula que rodea el dispositivo de la lesión. Pulse el botón ‘flecha’ en la esquina superior izquierda del control de movimiento VI la VI y haga clic en ‘Cerca de fondo’ para bajar del escenario para dentro de 2 mm de contacto con los penetradores. Haga clic en el botón ‘Stop’ para detener el VI.PRECAUCIÓN: Mantenga las manos alejadas de la camilla al manipular la cámara en la jaula. La jaula debe estar equipada con un interruptor de la puerta que entrega energía al dispositivo de estiramiento sólo cuando se cierra la puerta de la jaula. En la ventana proyecto, haga clic derecho sobre ‘Eje 1’. Haga clic en ‘Panel de prueba interactivos’. En la ventana que se abre, establezca el tamaño de paso a 50 μm por entrar en ‘500’ unidades en el campo ‘Target Position’. Haga clic en el botón ‘ir’ verde en la parte inferior de la ventana de ‘Panel de prueba interactivo’ varias veces hasta que la placa primero hace contacto con cualquier penetradores. Si hay contacto en la imagen en directo de la cámara. Nota informó de la posición vertical en la parte superior izquierda de la ventana de ‘Panel interactivo de prueba’; se trata de la primera posición de contacto. Más baja (como se describe en el paso 3.2.6) hasta que cada pozo ha hecho contacto con los penetradores. Si es necesario, mover la cámara para ver la placa entera y subir la etapa (especificando un negativo ‘posición de la blanco’) y hacia abajo. Nota informó de la posición vertical en la parte superior izquierda de la ventana cuando todos los mensajes están en contacto (esta es la posición de contacto). Nota la diferencia entre las posiciones de contacto y primer contacto. Cierre el ‘Panel de prueba interactivos’. Ejecutar el motion control VI (ver paso 3.2.4) y haga clic en ‘Top’ para levantar el escenario. Pare el control de movimiento VI con el botón ‘Stop’. Una vez que la etapa es en la parte superior de su recorrido, abrir la puerta para desactivar el dispositivo. Ajustar los tornillos en las esquinas del bloque del penetrador. Afloje el tornillo en la esquina que hace contacto primero, a bajar y apretar el tornillo opuesto para levantar la esquina que hace el último contacto. Repita el proceso de bajar la etapa hasta penetradores, inspeccionar las imágenes contacto para inclinar, levantar el escenario, en contacto con la placa y ajuste (paso 3.2.9) bloquear el penetrador. Cuando la etapa y los bloques están alineados, los penetradores hará contacto a la vez. Abrir la puerta para desactivar el dispositivo. Inserte los tornillos de sujeción en los orificios en el bloque de penetrador y apriete. Confirmar que el bloque esté nivelado con los tornillos de sujeción en su lugar (medidas 3.2.4-3.2.8). Tomar nota de la posición reportada por el ‘Panel de prueba interactivo’ cuando hace que la placa de contacto. Se trata de la posición cero para experimentos de indentación. Lubrique a los penetradores. Si el bloque de penetrador sólo ha creado y todavía no se ha lubricado, limpiar un cojín de goma maciza (7,5 x 11 cm x 1.5 mm) y una almohadilla de goma espuma suave, cerrado-célula (7,5 x 11 cm x 3 mm) con un paño empapado en etanol lab. Déjelos al aire seco. Remoje una toallita de laboratorio en aceite de maíz y extenderlo en el teclado de goma sólida para un brillo opaco. Coloque la almohadilla de espuma en la almohadilla de goma maciza para transferir petróleo a la almohadilla de espuma. Coloque un 7,5 x 11 cm x losa de aluminio de 0,5 cm encima de la almohadilla de espuma y cargar con un peso de lastre de aproximadamente 360 g (p. ej., 6 tubos cónicos con 45 mL de agua cada uno) para asegurar la transferencia constante de aceite de la almohadilla de goma sólida a la almohadilla de espuma. Permite 10 s para el aceite transferir a la almohadilla de goma espuma. Mueva la almohadilla de goma espuma en la matriz de penetrador. Coloque la placa de aluminio y el peso del lastre en la parte superior para asegurar a la transferencia constante de aceite a las puntas de los penetradores. Permite 10 s para el aceite transferir a los penetradores. Si no hay placa ha sido estirada desde el bloque de penetrador se constituyó y lubricado por primera vez, estirar una placa de prueba antes de comenzar el experimento.Nota: Esto evitará que cualquier incompatibilidad entre el primer tramo y posteriores tramos de confusión del experimento. Para los tramos subsiguientes, repita sólo pasos 3.3.2-3.3.5 antes de cada tramo. Estirar una placa. Lubrique a los penetradores como se describe en el paso 3.3. Fije la placa en el escenario del dispositivo de la lesión con las abrazaderas de la etapa. Si la esterilidad es necesaria, ajuste la posición de la tapa para garantizar la placa sin exponer la superficie de cultivo al aire de la habitación. Baje la etapa en la posición cero con el control de movimiento de ‘VI’ (ver pasos 3.2.4-3.2.6); posición de cero se determina en el paso 3.2. Cambiar el nombre del archivo en el campo “ruta de archivo” en la ‘posición de seguimiento VI’ a un nombre de archivo único, luego ejecute el botón ‘flecha’ en la esquina superior izquierda de esa ventana. Establecer la profundidad y la duración de sangría (típicamente 1-4 mm y 30 ms, respectivamente, profundidad 5 mm, duración mínima 15 ms) en los campos de ‘Lesiones duración (ms)’ en el ‘movimiento control panel VI’ haciendo clic en los campos y escribir en la posición deseada y ‘Lesión (mm)’ valores. Ejecute ‘movimiento control panel VI’ y haga clic en ‘Lesión’ guión la placa. Mover la etapa hasta la parte superior de su recorrido haciendo clic en el ‘Top’. Entonces deje la VI con el botón ‘Stop’ y desactivar el dispositivo de la lesión mediante la apertura de la puerta. Revise la historia del desplazamiento de la etapa en la ‘posición de perseguidor VI’ para confirmar que el desplazamiento máximo especificado se aplica. Haga clic derecho sobre el gráfico y haga clic en ‘exportar a Excel’. Haga clic en ‘ archivo | Guardar ‘ para guardar los datos. 4. Caracterización de estiramiento de la membrana Pintar el hueco en la parte superior de cada blanco penetrador para proporcionar un fondo de alto contraste para grabación de alta velocidad.PRECAUCIÓN: No pinte los bordes de los penetradores donde hacen contacto con las placas. 3D imprimir con poly(lactic acid) (PLA), o si no fabricar, un sello cilíndrico con el que hacer un punto en cada pozo. Hacer que el cilindro de 5,9 mm de diámetro y 12,2 mm de alto, con una saliente cilíndrica 1,5 mm de diámetro y 1,0 mm de alto, centrado en la parte superior.Nota: Para imprimir modelos 3D ‘ sello. STL’ está disponible como un archivo complementario. Plasma tratar la placa derecha hacia arriba para activar la superficie de cultivo celular de silicona en los pozos para 60 s, como se mencionó en el paso 2.1. Coloque la placa sobre un cojín de goma u otra superficie suave. Prime la pequeña protuberancia en el sello (ver paso 4.2) con tinta de un rotulador permanente. Inserte el sello en el pozo a ser probado y golpéelo para garantizar la buena transferencia de tinta. Cebe el sello antes de cada pozo. Alinee el bloque de penetrador y lubrique los penetradores del dispositivo lesiones (ver pasos 3.2-3.3). Abrazadera de la placa en el escenario del dispositivo de la lesión. Coloque una luz axial difusa brillante por encima del dispositivo de la lesión. Instaló una cámara de alta velocidad sobre un soporte del auge sobre el dispositivo de la lesión, mirando directamente hacia abajo, con el objetivo establecido en el diafragma más pequeño numerado y enciéndala. Ejecute el software de la cámara en el ordenador conectado a la cámara. En el marco tipo menú desplegable, seleccionados 2.000 marcos por segundo y en el obturador menú descienden, seleccione el más rápido tiempo de exposición que produce imágenes de alto contraste. Centro sobre los pozos puntos. Posición de la cámara para que el campo de visión contiene 12 pozos en una cuadrícula de 3 x 4.Nota: Este campo de visión ofrece un compromiso óptimo entre rendimiento y resolución de una imagen de 1.280 × 1.024. Baje la placa hasta el punto de cero (ver pasos 3.2.4-3.2.6). Un clic el registro botón de software de la cámara para que lea ‘disparador’. Iniciar el rastreador de posición VI (paso 3.4.4). Encienda la luz axial difusa. Aplicar sangría a la placa como se describe en el paso 3.4.6. Apague la luz axial difusa. En el equipo de control de cámara, encontrar la ventana de 30-40 ms de la grabación en la que se produce la sangría: arrastre las flechas de principio y fin en la barra de reproducción de vídeo de alta velocidad en el software de la cámara. Haga clic en guardar, establecer el nombre en el campo ‘Nombre de archivo’, seleccione ‘TIFF’ en el campo ‘Formato’ y haga clic en ‘Guardar’. Mirar a través del. TIF-archivos de imágenes de la más estiran (principio) y más estiran (sangría de pico) Estados. Para medir la altura y la anchura de los puntos en ambas imágenes, utilizar Fiji para abrir las imágenes de la menor y estiramiento de pico de lado a lado. Con la herramienta de selección rectangular predeterminada, haga clic y arrastre para dibujar un cuadro alrededor de un punto en la imagen menos estiramiento. Mida la altura y anchura con ‘ analizar | Medida ‘. Repita para el punto en el mismo pozo en el máximo estiramiento de imagen. Repita para el resto de los pozos. Calcular la tensión de Lagrange en las direcciones x e y como sigue:Nota: Aquí, Exx es la cepa de Lagrange en la dirección x , Eyy es la cepa de Lagrange en la dirección de y , X es el ancho del punto, Y es la altura del punto, f denota la imagen final (es decir, la imagen de marca de pico), y denota la imagen inicial (es decir, la imagen de la sangría). Promedio de los dos valores para determinar la tensión en ese pozo. 5. las células cultivadas de la galjanoplastia Autoclave de los recipientes y pesos de lastre que se utilizará para la esterilización. Plasma tratar la placas con fondo de silicona derecho hacia arriba por 60 s (consulte el paso 2.1). Inmediatamente sumergir las placas en recipientes estériles que contiene etanol al 70% durante 15 minutos. Sumergir las placas en tampón de fosfato estéril salino (PBS) en contenedores estériles separadas por 30 min. Aspire el PBS de los pozos. Sólo una placa seca a la vez para evitar que los pozos pierdan el tratamiento plasma.PRECAUCIÓN: Silicona placas fondo proporcionan retroalimentación táctil menos que las placas rígidas cuando pipeteo y están más probable bloquear la punta de una pipeta. Añadir 100 μl de 0,1 mg/mL poly-L-ornitina (OLP) por pozo a las placas estériles. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Enjuague los pozos dos veces con 100 μl PBS estéril, dejando el segundo lavado en los pocillos hasta la suspensión de células. Retire el frasco de hiPSCNs de almacenamiento de nitrógeno líquido, uso de guantes de seguridad y coloque en hielo seco. Transporte el frasco en un baño de agua de 37 ° C y descongelar durante exactamente 3 minutos rápidamente. No agite el frasco. En una campana estéril, transferir suavemente el contenido del vial a un tubo cónico de 50 mL con una pipeta serológica de 1 mL. Enjuagar el frasco vacío criogénico con 1 mL de medio de mantenimiento completo de temperatura ambiente (media base + suplemento). Transferir 1 mL de media en el tubo de 50 mL mediante goteo en aproximadamente una gota por segundo. Agitar suavemente el tubo mientras que la adición. Añada 8 mL de medio completo mantenimiento de temperatura en el tubo de 50 mL a 2 gotas/seg. Cerrar el tubo e invierta 2 – 3 veces. Contar las células con un hemocitómetro. Calcular el volumen de los medios adicionales necesarios para diluir la suspensión de células a 225.000 células/mL. Pipetee suavemente la cantidad de medios de comunicación (calculado anteriormente) en el tubo de la suspensión celular con una pipeta serológica de 25 mL. Añada 10 μl del stock de laminina 1 mg/mL por 1 mL de la suspensión celular con una micropipeta μL 1.000 para lograr 10 μg/mL de laminina en la suspensión de células. Aspirar hacia arriba y hacia abajo una vez con la punta que se utiliza para laminina, luego tapa el tubo e invierta el tubo una vez. Aspire el PBS de las placas, una placa a la vez. Utilice una pipeta multicanal para agregar 100 μl de la suspensión de células de hiPSCN a cada pocillo. Los pozos tienen un área de la cultura de 0,33 cm2, por lo que la densidad celular por área es de 67.500 células/cm2. Descansan las placas a temperatura ambiente durante 15 minutos después de la siembra para promover apego. Para evitar las vibraciones del ventilador de la campana de cultivo estériles, coloque las placas de cubierta en el Banco de laboratorio. Incubar los cultivos a 37 ° C con 5% CO2. Realizar un cambio completo de los medios de comunicación a las 24 h, rellenar los pozos con 200 μL de los medios de mantenimiento completa. Realizar media medios de comunicación el cambio de 100 μL/pocillo cada 2-3 días. 6. hiriendo a culturas Alinee el bloque de penetrador y encontrar la posición cero, como se describe en el paso 3.2. Lubrique a los penetradores como se describe en el paso 3.3. Establecer el nombre de archivo para la historia del desplazamiento en el ‘tracker de posición VI’ (paso 3.4.4). Configure los parámetros de lesión en el motion control VI (paso 3.4.5). Tomar la placa para ser herido fuera de la incubadora y fijarlo con la abrazadera en el escenario. Ajustar la posición de la tapa para garantizar la placa sin exponer a las culturas al aire de la habitación. Baje la placa en el punto cero (medidas 3.2.4-3.2.6) utilizando el motion control VI. Iniciar el ‘tracker de posición VI’ (paso 3.4.4). Utilice el control de movimiento VI guión la placa (como se describe en el paso 3.4.6). Para tramos de sham, omitir sólo este paso. Retomar la etapa de la parte superior de su rango de movimiento (ver paso 3.4.7). Vuelva la placa a la incubadora. Inspeccione y guardar el rastro de desplazamiento (como en el paso 3.4.8). 7. microscopía Preparar un 10 x coloración de la solución con 2 μg/mL Hoechst 33342 y 5 μg/mL de calceína AM en los medios de mantenimiento. La mancha cada uno con un pico de 20 μl de 10 x solución de tinción. Incubar por 15 min con la mancha en 37 ° C. Adquisición de imágenes fluorescentes de amplio campo. DAPI y FITC convencional de uso filtran de conjuntos a la imagen la calceína AM y señales de Hoechst 33342, respectivamente. Si la secuencia de imágenes múltiples bien llevará más de 10 minutos, adjuntar la placa en un incubador superior de etapa para mantener la salud de las culturas.Nota: Un 10 X, lente NA 0.30 provee suficiente detalle para determinación de viabilidad celular y la morfología. Ajuste de ganancias para asegurar la buena visualización de las neuritas, aunque esto causa cierta saturación del soma mucho más brillante. El segmento celular directo imágenes en el canal verde de calceína AM soma y neuritas. Utilizar imágenes nucleares en el canal azul de Hoechst 33342 para ayudar en la identificación del soma.

Representative Results

El dispositivo ensanchador es capaz de mover el escenario conlleva con duraciones de pulsos tan cortos como 10-15 ms según la amplitud del pulso (figura 2A). Las amplitudes de pulso son altamente repetibles, pero la duración del pulso varía de aproximadamente 1 ms entre las repeticiones. La amplitud del pulso real difiere de la amplitud de pulso prescrito cuando se carga un gran número de pozos, y la amplitud prescrita es alta (ver figura 2B). Como la amplitud del desplazamiento de fase se incrementa más allá de 3 mm, la amplitud de desplazamiento real incumple cada vez más la amplitud de desplazamiento indicado (ver figura 2B). Cuidado de alineación del bloque post elimina cualquier tendencia en la tensión de la membrana a través de filas o columnas (figura 2). En la mm 3,5 prescritas la amplitud de desplazamiento de fase (amplitud de desplazamiento real de 3,3 mm) con 52 pozos con sangría, la tensión media de Lagrange en todos los lugares bien fue 0.451 (desviación estándar de medios para todas las ubicaciones = 0.051, media de las desviaciones estándar para todas las ubicaciones = 0,065, n = 5 mediciones por pozo). Estos resultados se presentan aquí para integridad aunque algunos de ellos ya han sido reportados11. Una cultura óptima, ileso tendrá escasas matas de más de 5 células. Neuritas será individual, largos, delgados y curvados con poco o ningún signo de tensión o abalorios (Figura 3A). En condiciones ideales, la viabilidad de las culturas estrechamente debe abordar la viabilidad especificada en la hoja de datos del fabricante (normalmente 60-70%) y culturas de silicona deberían parecerse a los mantenidos en sustratos de cultivo rígidos convencionales ( Figura 3B). Neuritas pueden o pueden no ser visibles en un microscopio de campo brillante de baja potencia. Concentración de laminina y densidad celular influyen en cultivos al inicio y después de la lesión. Aumento de la densidad celular aumenta el número y tamaño de los grupos que formaron en la cultura. Aumento de la concentración de la laminina a menudo contrarrestar este efecto (Figura 3A). Sin embargo, aumentar la laminina concentración demasiado blunted la sensibilidad de las culturas a la lesión (figura 4). La concentración óptima del laminin para culturas ileso fue 50 μg/mL de laminina (figura 3), pero la separación óptima entre la población lesionada simulada y estiramiento se obtuvo en 10 μg/mL de laminina (figura 4). Concentraciones más altas de laminina reducen la sensibilidad de las culturas a lesiones en puntos de tiempo corto (figura 4), pero también base mayor viabilidad de las células en más puntos del tiempo (por ejemplo, 7 días). En Resumen, vale la pena para optimizar la concentración de laminina en cada escenario experimental. Tensión de la membrana, proyección de imagen punto de tiempo posterior a la lesión, laminina concentración y densidad celular ejercieron un efecto principal muy estadísticamente significativo en la longitud de la neurita por la célula (ANOVA, p < 0.001). El efecto de la tensión de la membrana en neurita largo por la célula tuvo interacciones muy estadísticamente significativas después de la lesión imagen tiempo punto y laminina concentración (ANOVA, p < 0,001) y una interacción estadísticamente significativa con la célula densidad (ANOVA, p < 0.05). Del mismo modo, la tensión de la membrana, después de la lesión punto del tiempo, la proyección de imagen celulares densidad, y laminina concentración todos ejercieron un efecto principal muy estadísticamente significativo en viabilidad celular (ANOVA, p < 0.001). El efecto de la tensión de la membrana sobre la viabilidad celular tenía una interacción estadísticamente muy significativa con el punto del tiempo imágenes de la lesión (ANOVA, p < 0,001) y una interacción estadísticamente significativa con la densidad celular (ANOVA, p < 0.05). Estos resultados demuestran que sincronización, densidad celular y laminina concentración ejercen una influencia importante sobre la relación entre el insulto aplicado y los resultados experimentales, por lo que cada uno debe ser optimizado con cuidado. Viabilidad celular baja y neuritas con cuentas, junto con el crecimiento de la neurita atrofiado, indican condiciones de cultura tóxica que pueden surgir del mal prepararon del silicón. Omitiendo o acortando el remojo de agua o el horno seco puede dejar etanol absorbido o agua en la membrana, respectivamente, que se puede difundir en los medios de comunicación y estrés las células. Culturas bien lesionadas habrá reducido viabilidad celular, neurites acortados o falta, neuritas con cuentas y neurites que tensa o tensionado. Lesión puede provocar aglutinación en cultivos celulares que fueron bien dispersa antes de la lesión. Grumos grandes pueden confundir el análisis morfológico. Para análisis morfológico, debe ajustarse el nivel de lesión que ocurren cambios notables, pero las células todavía están presentes con algunas neuritas. Figura 1 : Etiquetado esquemático del dispositivo de lesiones A. (A) vista superior, vista isométrica (B), (C) vista frontal, vista de lado derecho (D). La barra de escala se aplica a las vistas ortogonales (A, B y D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Cinemática de la injuria mecánica. (A) el desplazamiento de fase historias sobre 5 pulsos en el rango de amplitudes prescritas (amplitudes prescritas figuran en la leyenda) cuando no se cargan pozos. (B) el desplazamiento de fase historias sobre 10 pulsos en el rango de amplitudes prescritas (amplitudes prescritas figuran en la leyenda) cuando se cargan 52 pozos. (C) la tensión media en cada pocillo con una amplitud de desplazamiento de fase de 3,3 mm (n = 5 mediciones por pozo, media de error estándar por pozo = 0.029). Cuenta que el C4-F4 y F9 C9 son pocillos de control sin estirar. Esta figura ha sido modificada desde Sherman et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Optimización de la cultura condiciones en silicona. (A) el efecto de variar la concentración de densidad y laminina células en culturas hiPSCN de silicona. Agrupar aumenta con el aumento de la densidad celular y disminuyendo la concentración de laminina. Densidad y laminina la concentración de la célula debe optimizarse para lograr cultivos dispersos de mono. Dispersión de mono cultivos son menos vulnerables a los artefactos durante la cuantificación. Tenga en cuenta que el rango dinámico ha sido ajustado para optimizar la visualización de las neuritas. Como consecuencia, se saturan mucho soma más brillante. Esta presentación es preferible a la alternativa de optimizar el rango dinámico en relación con el soma, que hace mucho neurites el amortiguador casi invisible. La condición resaltada en la Plaza Roja se consideraba óptimo para los experimentos en vitro lesión de estiramiento. (B) bajo condiciones óptimas, las culturas en las membranas de silicona parecen similares a las culturas en sustratos rígidos convencionales. El panel izquierdo muestra hiPSCNs cultivadas en 33.750 células/cm2 con 3.3 μg/mL de laminina en una placa de 96 pozos convencional, rígida (el sustrato de la cultura de célula es un copolímero de olefina cíclica de cultivo de tejidos tratado). El panel de la derecha reproduce el panel en rojo de (A). Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : El fenotipo de la lesión y su dependencia de concentración de laminina. (A) la cultura sana, utilizando 10 μg/mL laminina y células 67.500/cm2. Neuritas son con no granos. Hay pocos núcleos muertos y algunos grupos. Cultura (B) utilizando las mismas condiciones de cultivo, heridas con tensión de pico de 57% y fotografiada después de 4 h. Neurites se acortan o faltantes y algunos tienen granos (indicados por las flechas). Hay menos células de calceína AM-positivo y más negativo calceína AM núcleos (es decir, muertos). Lesión ha aumentado aglutinación entre las células supervivientes. (C) 4 h después de la lesión, longitud neurite por la célula disminuye con el aumento de la tensión de una manera que depende de la concentración de laminina. (D) 4 h después de la lesión, viabilidad de las células disminuye con el aumento de la tensión de una manera que depende de la concentración de laminina. (E) 24 h después de la lesión, neurita largo por la célula disminuye con el aumento de la tensión de una manera que depende de la concentración de laminina. (F) 24 horas después de la lesión, viabilidad de las células disminuye con el aumento de la tensión de una manera que depende de la concentración de laminina. (n = 4 por bar, barras de error son ± 1 desviación estándar, barras de escala = 100 μm). Valores de tensión se deducen por desplazamiento de fase utilizando los datos de una publicación previa por Sherman et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Suplementario Figura 1: dibujo del penetrador técnico. Haga clic aquí para descargar esta figura. 1 mesa adicional: costumbre construido dispositivos. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Complementario tabla 2:96 placa bien-cargador Pinout esquema eléctrico. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Archivo de código complementario 1: dibujos de diseño asistido por ordenador del dispositivo lesiones. Haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 2: dibujos de diseño asistido por ordenador de la abrazadera de la fabricación de placa. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo de código complementario 3: representación 3D de la geometría del sello, conveniente para el uso con una impresora 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 4: SubVI para MuStLiMo_si_initialize.vi, que es un SubVI para motion_control.vi. Convierte las entradas en los cuadros de diálogo en parámetros para el movimiento. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 5: SubVI para múltiples Moves_simplified.vi de línea recta, que es un SubVI para motion_control.vi. Convierte las entradas en los cuadros de diálogo en parámetros para el movimiento. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 6: SubVI para position_tracker.vi. Desplazamiento de pistas contador de entrada de encoder lineal. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo de código complementario 7: Base de LabVIEW proyecto. Haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 8: Top nivel VI que se mueve el dispositivo de. Haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 9: SubVI para motion_control.vi. Ejecuta el desplazamiento rápido que se extiende la placa. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 10: SubVI para motion_control.vi. Ejecuta el desplazamiento lento que se mueve de la etapa. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo de código complementario 11: SubVI para motion_control.vi. Traza una historia de desplazamiento (generalmente sobremuestreadas) en el panel de control motion_control.vi. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 12: Top VI nivel que registra la historia de la dislocación. Haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 13: contiene Variable2, que comunica entre motion_control.vi y position_tracker.vi. Haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 14: manual de reparacion para tarjeta de circuitos impresos. Haga clic aquí para descargar este archivo. Complementaria código archivo 15: diseño de circuitos impresos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La clave para obtener una constante, biofidelic fenotipo en este modelo es aplicar un insulto mecánico constante biofidelic. Este modelo puede generar pulso duraciones tan cortas como 10-15 ms, que son similares a las duraciones de pulso para impactos humanos cabeza según experimentos cadavéricos12,13. La consistencia de este insulto depende de la alineación de la placa con el bloque del penetrador y la lubricación constante de los penetradores. Cuando el bloque de penetrador está bien alineado, no hay ninguna tendencia en la tensión aplicada a través de filas o columnas (figura 2). Una fina capa de lubricante por lo general crea menos fricción que una capa gruesa, y grasas viscosas no se recomiendan porque falta la silicona y obstruir el paso de la luz durante la microscopia. La amplitud de desplazamiento de fase real bajará sustancialmente por debajo de la amplitud de desplazamiento prescrito cuando se utilizan muchos penetradores, y la amplitud de desplazamiento de fase prescrita es grande (> 3 mm). Sin embargo, mientras que el desplazamiento real es menor que el desplazamiento indicado en grandes amplitudes, es repetible (figura 2B). Por lo tanto, amplitudes desplazamientos grandes, real pueden obtenerse con fiabilidad introduciendo un valor prescrito que exceda el valor deseado. Amplitud de desplazamiento es importante sólo porque es un proxy fácilmente registrado para la cepa de la membrana del pico, que mide directamente el insulto mecánico que induce patología. Por lo tanto, el procedimiento descrito para determinar la tensión de la membrana de desplazamiento de fase es crítico. Este proceso debe repetirse si cualquier principales se realizan cambios en el sistema que afectan la interacción entre la placa y los penetradores, por ejemplo si diferentes penetradores del diámetro del penetrador diferentes o recubrimientos y materiales diferentes tipos de silicona placa de fondo se utilizan. Al inicio de cada experimento debe repetirse el proceso de realinear el bloque del penetrador y la determinación de la posición cero. Un esquema del dispositivo que se muestra en la figura 1. Modelos CAD necesarios para reproducir el dispositivo se ofrecen como materiales complementarios: ‘ dispositivo de lesiones – conjunto completo – 3D genérico. PASO ‘; la cuenta asociada de materiales proporcionados como1 mesa adicional: costumbre construido dispositivos – BOM.xlsx. También vea _loader complementario 2 96 bien placa de mesa de – Diagram.xlsx de cableado de Pinout, que describe las conexiones de cableado que conectan los diversos componentes de los sistemas. ‘Interconnector_circuit_board.dip’ describe una placa de circuito que interconecta los cables.

Si el dispositivo se desactiva la etapa cerca de la mitad de su recorrido, el escenario se moverá después de que la energía está cortada porque está accionada por resorte. Cuando la energía es restaurada, el bucle de realimentación detecta una gran diferencia entre la última posición conocida de prescrita y la posición real. Esto hará que el escenario pasar pronto a la posición fue en cuando el dispositivo fue desactivado. Este movimiento repentino puede provocar errores en la salida del codificador, por lo que debe tenerse cuidado para desactivar el dispositivo cuando lo es en su posición de reposo en la parte superior de su recorrido.

La abrazadera de fabricación está diseñada para unir la placa inferior cuerpo y silicona de manera que permite una óptima adhesión. Para ello, existen tres características principales en el diseño presentado en el archivo suplementario ‘ prensa morir – 3D genérico. PASO ‘. En primer lugar, el titular de cuerpo de abrazadera placa es paralelo a la base de silicona. Si esto está correctamente construido, no requerirá ningún ajuste después de la configuración inicial. En segundo lugar, la capa de goma espuma en la abrazadera proporciona una pequeña cantidad de cumplimiento debajo de la placa, como un sistema completamente rígido teóricamente experimentaría un aumento repentino de cero fuerza de sujeción a la infinita fuerza de sujeción cuando se cerró la pinza. La posición de la barra de montaje y tornillo de la abrazadera son ajustables para que la distancia entre los dos lados de la pinza puede ser optimizada.

Debe hacer todo lo posible para proporcionar un fondo brillante, blanco detrás del punto en la parte inferior bien durante experimentos de caracterización de cepa. Mejor el contraste en estas imágenes, más fácil será para automatizar el proceso de medición de la altura y la anchura del punto, que puede llegar a ser tedioso para un operador humano analizando un experimento grande. Grabación alta velocidad de la parte inferior de un pozo en una placa de 96 pocillos presenta desafíos debido a las paredes del pozo tienden a proyectar sombras. El uso de una cúpula de luz o luz difusa axial que puede iluminar a lo largo de la línea de la vista de la cámara sin oscurecimiento de la imagen elimina las sombras o reflejos especulares que se produciría con una fuente de luz convencional. La más brillante fuente de luz disponible debe utilizarse porque brillante iluminación permite que las imágenes que se adquirirá con un tiempo de exposición corto. Tiempos de exposición cortos minimizan el desenfoque de movimiento. Actualizar los diodos electroluminosos (LED) en la difusa luz axial permite tiempos de exposición más cortos durante la adquisición de vídeo de alta velocidad. Los LEDs pueden actualizarse con la apertura de la difusa luz axial, quitar la culata LED, montaje 4 de alta potencia LED matrices en el panel posterior usando LEDs titulares, se conectan a una fuente de energía actual constante y volver a montar la luz axial difusa (ver tabla de Materiales para números de catálogo). La desventaja de actualizar los LEDs es que los LEDs pasivamente refrigerados no se puede mantener más de unos segundos debido al riesgo de sobrecalentamiento. Por lo tanto, se necesita una luz diferente alineación del ajuste posterior al bloque y la cámara.

El método presentado de cuantificación de la tensión de la membrana mediante la medición de la dilatación de un punto estampado a la membrana es relativamente Tosca, pero puede escalar a varios pozos de una manera robusta. El campo de tensión en la parte inferior bien puede ser caracterizado en detalle mediante correlación digital de imágenes. Esta técnica consiste en pulverizar un patrón moteado en la base del pozo y luego la proyección de imagen en alta velocidad durante la deformación. Software comercial puede utilizarse entonces para cuantificar la tensión en cada punto de la imagen mediante el seguimiento de la evolución del patrón moteado.

Este protocolo produce un fenotipo de lesiones múltiples facetas, clínicamente relevantes, estiramiento en hiPSCNs. Muerte celular y degeneración de la neurita neurite de rebordear son secuelas todo bien documentados de TBI en humanos y modelos animales15. La clave del éxito en este modelo es establecer y mantener cultivos sanos. En términos generales, un protocolo de cultivo celular convertido placas rígidas convencionales es un punto de partida que vale la pena para la cultura de la placa elástica. Sin embargo, la posibilidad de que las células en cuestión pueden responder diferentemente de silicona debe ser considerada siempre. Esto es particularmente cierto de hiPSCNs, que son muy sensibles a las condiciones de cultivo. Algunos ejemplos de optimización de la densidad y laminina la concentración de células se suministran en la sección de Resultados de representante de (figura 3, figura 4). Activación de la silicona con el tratamiento de plasma es vital. La silicona es hidrofóbico y no reacciona; en su estado natural, no se unirá a laminina u otras moléculas utilizados para promover la fijación de la célula. Tratamiento de plasma hace que la superficie hidrofílica y expone grupos reactivos. Estos cambios permiten que las moléculas de adhesión enlazar a la silicona y promover la fijación de la célula. Es importante tener en cuenta que el efecto del tratamiento plasma se disipa dentro de minutos a menos que la superficie quede sumergida en el líquido, y por lo que procedimientos que involucran el secado de la superficie activa deben realizarse tan pronto como sea posible. Una forma sencilla de comprobar si el efecto del tratamiento con plasma ha usado es colocar una gotita de agua en la superficie. De silicona sin tratar, la gota se grano para arriba mientras que el plasma Tratado de silicona, se extenderá hacia fuera. Con la hiPSCNs que hemos utilizado (véase Tabla de materiales), el fabricante recomienda añadir la laminina con la suspensión de células en lugar de la capa. Este protocolo ha incorporado este enfoque con éxito. Segmentación puede, en teoría, realizar con software de código abierto o de uso general lenguajes de programación, un alto grado de competencia con estas herramientas es necesaria para obtener buenos resultados. Neuritas son con frecuencia difíciles de distinguir de la señal de fondo porque son tan delgados. Por lo tanto, recomendamos el uso de herramientas de software comercial distribuido por empresas de alto contenido microscopia con módulos dedicados para segmentación y cuantificación de las neuronas, si están disponibles. Incluso con el software comercial, es aconsejable exportar imágenes de la segmentación para verificar visualmente la exactitud.

Existen algunas limitaciones asociadas con el trabajo en placas estirables en comparación con el trabajo con las placas convencionales, rígidas. Placas elásticos pueden ser reflejadas como normal con objetivos de aire. Sin embargo, la proyección de imagen con objetivos de inmersión es muy difícil. Lente de aceite puede dañar la silicona. Además, el objetivo ejerce una presión sobre la membrana de silicona mientras se mueve hacia arriba. Esta presión desplaza la membrana verticalmente, lo que dificulta llevar la muestra en foco. Las membranas de silicona utilizadas actualmente en la fabricación de las placas son aproximadamente 250 μm de espesor. Este espesor excede la distancia focal de alta potencia muchos, objetivos de inmersión. Debe tener especial cuidado para poner las membranas perfectamente antes de sujeción para lograr la planeidad necesaria para microscopía. Sistemas de enfoque automático pueden compensar desviaciones en la llanura de la placa acabada hasta cierto punto. Las versiones futuras del protocolo pueden tense la membrana antes de que está unido a la parte superior de la placa para asegurar la llanura. El procedimiento libre de adhesivo para la Unión de la membrana de silicona a la placa superior14 se considera una fuerza importante del protocolo actual. Elimina el riesgo de neurotoxicidad de la adhesiva, así como cualquier desviación en planitud debido al espesor no uniforme de la capa de adhesivo.

Electrodos múltiples arreglos de discos se usan en experimentos con hiPSCNs para evaluar su madurez y su funcionalidad. Desafortunadamente, estos sistemas son incompatibles con este modelo porque el sustrato de cultivo celular es rígido. Es posible crear una matriz multi-electrodo estirable, aunque esto se hasta el momento sólo ha demostrado en un solo bien formato16,17. Tenga en cuenta que penetradores pueden extraerse individualmente el bloque de indentación para que algunos pozos no se sangran y pueden servir como impostores. Quitar al penetrador previene el sangrado pero no eliminar por completo mecánica carga puesto que hay todavía inercia movimiento del líquido en los pozos mientras que el escenario se está moviendo. Vale la pena comparar estos pozos a pocillos de placas que fueron nunca objeto de movimiento etapa para medir la influencia patológica de movimiento fluido. Además, la matriz de penetradores en el bloque debe ser bisymmetric (simétrico de adelante hacia atrás y de lado a lado). Esta precaución asegura que la placa se carga uniformemente durante la sangría, para que la etapa no incline hacia los lados y causar las varillas atar en sus rodamientos.

Uno de los retos principales en la innovación terapéutica en neurotrauma es la complejidad y heterogeneidad de la condición. Trauma aplica estrés multimodal a cada tipo de célula en el sistema nervioso central al mismo tiempo. Las neuronas se han generado fiable de las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) y están ahora ampliamente disponibles de proveedores comerciales. Innovación está procediendo rápidamente en este campo, y también se derivan otros tipos de células neuronales tales como astrocytes18 y microglia19 de hiPSCs. Pronto puede ser posible aislar las respuestas celular Autónoma de cada uno de estos tipos celulares a trauma en vitro y luego a co cultura diferentes tipos de células para entender cómo se comunican después de trauma. De esta manera, es en última instancia posible recrear el desafío clínico desde el fondo hasta entenderlo completamente en un sistema humano. Este enfoque difiere de la aproximación convencional basándose en modelos de roedores y tiene el potencial para generar nuevos conocimientos que conducen a las primeras terapias para esta condición de comunes, devastador e intratable.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo es apoyado en parte por una subvención de los institutos nacionales de salud (R21NS098129). Queremos reconocer la excelente asistencia técnica de SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng y Feng Yuan Bu, que diseñó y construyó una estructura para soportar luces usadas durante los experimentos de proyección de imagen de alta velocidad que se describe en este manuscrito .

Materials

.010" Silicone Sheet Specialty Manufacturing, Inc #70P001200010 Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet
Sparkleen Fisher Scientific  #043204
Nunc 256665 Fisher Scientific  #12-565-600 Bottomless 96 Well Plate
Kim Wipes ULINE S-8115
Plasma Cleaner Harrick Plasma #PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich #440140 APTES
Parchment Paper Reynolds N/A
Dome Light CCS inc LFX2-100SW
Dome Light Power Supply CCS inc PSB-1024VB
Axial Diffuse Lighting Unit             Siemens Nerlite DOAL-75-LED Diffuse axial light
High Power LED Array                 CREE XLamp CXA2540 High Power LED Array                
LED holder Molex 1807200001 LED Holder  
LED power supply Mean Well HLG-320H-36B Constant Current Power Supply   
FastCam Viewer software  Photron camera softeware
Fastcam Mini UX50 Photron N/A High Speed Camera
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 Nikon #1455 High Speed Camera Lens
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich #P4597
iCells Cellular Dynamics International #NRC-100-010-001
iCell media Cellular Dynamics International #NRM-100-121-001 
iCell supplement Cellular Dynamics International #NRM-100-031-001
Laminin Sigma-Aldrich #L2020
Hoechst 33342 Fisher Scientific  #H3570
Calcein AM Fisher Scientific  #C3099
voice coil actuator  BEI Kimco LA43-67-000A 
optical linear encoder  Renishaw T1031-30A 
servo drive Copley Controls Xenus XTL 
Controller National Instruments cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller 
cRIO chassis National Instruments cRIO 9113
digital input module National Instruments NI 9411
data acquistion chassis National Instruments NI 9113
LabVIEW National Instruments instrument control software
hiPSCNs Cellular Dynamics International
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Referências

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Phillips, J. K., Sherman, S. A., Oungoulian, S. R., Finan, J. D. Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format. J. Vis. Exp. (134), e57305, doi:10.3791/57305 (2018).
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