Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti
Summary
Qui presentiamo un metodo per un modello umano in vitro della lesione elasticizzato in un formato a 96 pozzetti su una scala cronologica pertinente all’impatto del trauma. Sono inclusi i metodi per la realizzazione di piastre stretchable, quantificare l’insulto meccanico, coltura e ferendo le cellule, imaging e alto contenuto analisi per quantificare il danno.
Abstract
Ferita di cervello traumatica (TBI) è una grande sfida clinica con un’elevata morbilità e mortalità. Nonostante decenni di ricerca pre-clinica, non sono state sviluppate terapie dimostrate per TBI. Questa carta presenta un nuovo metodo per la ricerca pre-clinica neurotrauma destinato a integrare i modelli pre-clinici esistenti. Essa introduce fisiopatologia umana attraverso l’uso di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCNs). Realizza il caricamento impulso durata simile alle durate di caricamento delle cliniche chiuso urto della testa ferita. Si avvale di un formato di 96 pozzetti che facilita gli esperimenti elevato throughput e fa un uso efficiente delle cellule costose e reagenti di cultura. Membrane in silicone vengono prima trattate per rimuovere neurotossico polimero non vulcanizzato e quindi legate agli organismi commerciali piastra a 96 pozzetti per creare stretchable piastre da 96 pozzetti. Un dispositivo su misura viene utilizzato per far rientrare alcuni o tutti i fondi ben da sotto, che inducono sollecitazioni meccaniche equibiaxial che ferisce meccanicamente le cellule in cultura nei pozzetti. Il rapporto tra profondità di rientro e sollecitazioni meccaniche è determinato empiricamente utilizzando Videografia ad alta velocità dei fondali ben durante il rientro. Cellule, tra cui hiPSCNs, possono essere coltivate su queste membrane in silicone utilizzando versioni modificate dei protocolli della coltura cellulare convenzionale. Immagini al microscopio fluorescente di colture cellulari sono acquisiti e analizzati dopo la ferita in modo semi-automatico per quantificare il livello della lesione in ciascun pozzetto. Il modello presentato è ottimizzato per hiPSCNs ma in teoria potrebbe essere applicato ad altri tipi di cella.
Introduction
TBI è delle principali cause di mortalità e di morbosità negli Stati Uniti, causando circa 52.000 morti e 275.000 ospedalizzazioni ogni anno1. Più di 30 studi clinici di terapeutica candidato per TBI sono stati condotti senza un singolo successo2. Questo fallimento uniforme suggerisce che umani specifici processi separano TBI umano dalla fisiopatologia osservata nei modelli del roditore pre-clinici comunemente utilizzati.
L’avvento di hiPSCNs ha creato un’opportunità per studiare neurotrauma in un modello umano in vitro . Lo screening con modelli basati su hiPSCN può trasportare i risultati che sono più predittivi di successo clinico rispetto ai modelli che impiegano cellule di roditore. Inoltre, i hiPSCNs possono essere manipolati geneticamente per isolare e studiare l’effetto delle varianti genetiche umane individuali sulla patologia3.
Il metodo descritto in questo manoscritto è progettato per portare i vantaggi unici di malattia hiPSCN-base di modellazione di neurotrauma. In vitro modelli di lesione stretch del neurotrauma sono ben consolidata4,5,6 con cellule di roditore primarie e linee cellulari tumorali neurali umane. La maggior parte di questi modelli generano tratto dal caricamento pneumatico di una membrana di silicone. Questo approccio è efficace in un unico formato bene ma ha dimostrato difficile da scalare fino a un formato multi-pozzetto7. Di conseguenza, non c’è una schermata di throughput elevato per gli agenti trattare stretch neuroni feriti.
In questo modello, la membrana si estende a causa di rientro da sotto con un penetratore rigido. Questo approccio è stato indicato più volte per generare patologia clinicamente rilevante in vitro in singoli sistemi ben8,9,10. Il nostro lavoro recente ha indicato che esso facilmente scale up in un formato a 96 pozzetti, mantenendo le durate di impulso nell’ordine di decine di millisecondi11, ovvero il tempo chiuso dominio di urto della testa eventi12,13.
In sintesi, i principali vantaggi di questo modello di ferita in vitro sono il formato di 96 pozzetti, l’uso di hiPSCNs e nel dominio del tempo clinicamente rilevanti dell’insulto.
Protocol
Representative Results
Discussion
La chiave per ottenere un coerente, biofidelic fenotipo in questo modello è l’applicazione di un insulto meccanico biofidelic coerente. Questo modello può generare impulsi durate più brevi 10-15 ms, che sono simili per le durate di impulso per impatti antropici testa secondo esperimenti cadaverico12,13. La consistenza di questo insulto dipende l’allineamento della piastra con il blocco del penetratore e lubrificazione costante dei penetratori. Quando il blocco di penetratore è ben allineato, non c’è nessuna tendenza nel ceppo applicato in righe o colonne (Figura 2). Un sottile strato di lubrificante in genere crea meno attrito di uno strato spesso e viscosi grassi non sono raccomandati perché fallo il silicone e ostruire il passaggio della luce durante la microscopia. L’ampiezza di spostamento di fase reale può inferiori sostanzialmente l’ampiezza di spostamento prescritto quando molti penetratori sono utilizzati, e l’ampiezza di spostamento di fase prescritto è grande (> 3 mm). Tuttavia, mentre lo spostamento reale è inferiore la cilindrata prescritta a grandi ampiezze, rimane ripetibile (Figura 2B). Di conseguenza, ampiezze di spostamenti di grandi, effettivo possono essere ottenute in modo affidabile immettendo un valore prescritto eccedente il valore desiderato. Ampiezza di spostamento è importante solo perché è un proxy facilmente registrato per il ceppo di membrana di picco, che misura direttamente l’insulto meccanico che induce la patologia. Pertanto, la procedura descritta per determinare la deformazione della membrana dallo spostamento di fase è fondamentale. Questo processo deve essere ripetuto se importanti vengono apportate modifiche al sistema che influenzano l’interazione tra la piastra e i penetratori, ad esempio se diversi penetratori di diametro, penetratore diversi materiali o rivestimenti o diversi tipi di silicone vengono utilizzati a fondo piatto. Il processo di riallineamento del blocco del penetratore e determinare la posizione di zero deve essere ripetuto all’inizio di ogni esperimento. Un disegno schematico del dispositivo d’allungamento è illustrato nella Figura 1. Modelli CAD necessari per riprodurre il dispositivo vengono forniti come materiali supplementari: ‘ lesione periferica – FULL ASSEMBLY – 3D generico. PASSO ‘; il conto associato di materiali forniti comesupplementare tabella 1: Custom costruito dispositivi – BOM.xlsx. Vedi anche complementare tabella 2 96 ben piastra _loader – Pinout cablaggio Diagram.xlsx, che descrive i collegamenti di cavi che collegano i vari componenti dei sistemi. ‘Interconnector_circuit_board.dip’ descrive un circuito che collega i cavi.
Se il dispositivo è disattivato con il palco vicino alla metà della sua corsa, il palco si muoverà dopo il potere è tagliato fuori, perché è a molla. Quando l’alimentazione viene ripristinata, il circuito di retroazione è in grado di rilevare una grande differenza tra l’ultima posizione nota prescritta e la posizione effettiva. Questo farà sì che la fase spostare improvvisamente la posizione che era in quando la periferica è stata disattivata. Questo movimento improvviso può causare errori nell’output dell’encoder, quindi cura deve essere presa per disattivare il dispositivo solo quando è nella sua non alimentato a riposo posizione nella parte superiore della sua corsa.
Il morsetto di montaggio è progettato per portare la parte inferiore del corpo e silicone piastra insieme in un modo che permette di incollaggio ottima. A tal fine, ci sono tre caratteristiche fondamentali nella progettazione presentata nel file supplemento ‘ Press Die – 3D generico. PASSO ‘. In primo luogo, il portatarga del corpo pinza è parallela al fondo del silicone. Se questo è costruito correttamente, non sarà necessario alcun aggiustamento dopo l’installazione iniziale. In secondo luogo, lo strato di gommapiuma nel morsetto fornisce una piccola quantità di conformità sotto la piastra, come un sistema completamente rigido teoricamente subirebbe un aumento improvviso da zero forza di serraggio a forza di serraggio infinito quando il morsetto è stato chiuso. La posizione della traversa e la vite del morsetto sono regolabili in modo che la distanza tra i due lati del morsetto può essere regolata.
Ogni sforzo dovrebbe essere fatto per fornire uno sfondo luminoso e bianco dietro il punto sul fondo ben durante gli esperimenti di caratterizzazione del ceppo. Meglio il contrasto in queste immagini, più facile sarà per automatizzare il processo di misurazione l’altezza e la larghezza del punto, che può diventare noioso per un operatore umano analizzando un grande esperimento. Alta velocità videografia di fondo di un pozzo in una piastra a 96 pozzetti presenta sfide perché le pareti del pozzo tendono a proiettare ombre. L’utilizzo di una cupola di luce o luce diffusa assiale che può illuminare lungo la linea di vista della telecamera senza oscurare l’immagine Elimina le ombre o riflessi speculari che sorgerebbero con una sorgente di luce convenzionale. La sorgente di luce più luminosa disponibile deve essere utilizzata perché illuminazione luminosa consente immagini essere acquisiti con un tempo di esposizione breve. Tempi di esposizione brevi ridurre al minimo la sfocatura di movimento. L’aggiornamento i diodi luminosi (LED) a luce diffusa assiale permette tempi di esposizione più brevi durante l’acquisizione di video ad alta velocità. I LED possono essere aggiornati aprendo la luce diffusa assiale, togliere il calcio LED, montaggio 4 ad alta potenza LED matrici per il pannello posteriore usando supporti LED, collegandoli a un alimentatore di corrente costante e riassemblando la luce diffusa assiale (Vedi tabella di Materiali per i numeri di catalogo). Lo svantaggio di aggiornamento i LED è che i LED passivamente raffreddati non possono essere mantenuti per più di pochi secondi a causa del rischio di surriscaldamento. Pertanto, una luce diversa è necessaria per l’allineamento delle regolazioni post-blocco e fotocamera.
Il metodo di quantificazione del ceppo di membrana misurando la dilatazione di un puntino timbrato sulla membrana è relativamente grezzo, ma può scalare fino a pozzi multipli in modo robusto. Il campo di deformazione nella parte inferiore ben possa essere caratterizzato in modo più dettagliato utilizzando la correlazione di immagini digitali. Questa tecnica comporta un modello macchiato sulla base del pozzo di spruzzatura e quindi imaging a alta velocità durante la deformazione. Software commerciale è utilizzabile quindi per quantificare la deformazione in ogni punto dell’immagine tenendo traccia l’evoluzione del modello macchiato.
Questo protocollo produce un fenotipo di lesioni clinicamente rilevanti, elastico e multi-sfaccettato in hiPSCNs. Morte delle cellule, la degenerazione del neurite e neuriti perline sono tutto ben documentato le conseguenze di TBI in esseri umani e animali modelli15. La chiave del successo in questo modello è stabilire e mantenere sane culture. In generale, un protocollo di cultura cellulare sviluppato con placche rigide convenzionali è un utile punto di partenza per cultura piastra estensibile. Tuttavia, la possibilità che le cellule in questione possono rispondere diversamente sul silicone sempre deve essere considerata. Ciò è particolarmente vero di hiPSCNs, che sono molto sensibili alle condizioni di coltura. Alcuni esempi di ottimizzazione della concentrazione cellulare densità e laminin sono forniti nella sezione Risultati rappresentante (Figura 3, Figura 4). Attivazione del silicone con il trattamento al plasma è di vitale importanza. Il silicone è idrofobo e non reattivo; nel suo stato naturale, esso non verrà associato alla laminina o altre molecole utilizzati per promuovere l’adesione delle cellule. Trattamento al plasma rende la superficie idrofila ed espone gruppi reattivi. Queste modifiche consentono di molecole di adesione legare al silicone e di promuovere il collegamento delle cellule. È importante notare che l’effetto del trattamento al plasma si disperde all’interno di minuti a meno che la superficie sia immerso nel liquido, e quindi procedure che coinvolgono la superficie attivata di essiccazione devono essere eseguite più rapidamente possibile. Un modo semplice per verificare se l’effetto del trattamento al plasma ha portato fuori è quello di mettere una goccia di acqua sulla superficie. Il silicone non trattato, la gocciolina verrà tallone fino mentre il plasma trattato in silicone, si diffonderà. Con la hiPSCNs che abbiamo utilizzato (Vedi Tabella materiali), il produttore consiglia di aggiungere la laminina con la sospensione cellulare piuttosto che pre-rivestimento. Questo protocollo è ripreso con successo questo approccio. Mentre segmentazione può, in teoria, essere realizzato con software open source o linguaggi di programmazione generici, un elevato grado di competenza con questi strumenti è necessaria per ottenere buoni risultati. Neurites sono spesso difficili da distinguere da segnale di fondo perché sono così sottili. Pertanto, si consiglia l’uso di strumenti software commerciali distribuiti dalle società di alto contenuto microscopia con moduli dedicati per la segmentazione e quantificazione dei neuroni, se disponibili. Anche con il software commerciale, si consiglia di esportare immagini della segmentazione di verificare visivamente la precisione.
Ci sono alcune limitazioni connesse con l’utilizzo di piastre stretchable rispetto a lavorare con piastre convenzionali, rigidi. Stretchable piastre possono essere imaged come di consueto con gli obiettivi dell’aria. Tuttavia, la formazione immagine con obiettivi di immersione è molto difficile. Olio di lente può danneggiare il silicone. Inoltre, l’obiettivo esercita una pressione sulla membrana in silicone che si muove verso l’alto. Questa pressione si sposta la membrana verticalmente, rendendo difficile mettere a fuoco il campione. Le membrane in silicone attualmente utilizzate nella fabbricazione le piastre sono circa 250 µm di spessore. Questo spessore supera la distanza focale di molti ad alta potenza, obiettivi di immersione. Deve prestare particolare attenzione a posare le membrane perfettamente piatto prima del serraggio per ottenere la planarità necessaria per microscopia. Sistemi autofocus possono compensare le deviazioni nella planarità del piatto finito in una certa misura. Le versioni future del protocollo precarico la membrana prima è legato alla parte superiore della piastra per garantire la planarità. La procedura senza adesivo per l’incollaggio della membrana di silicone al piatto top14 è considerata un importante punto di forza dell’attuale protocollo. Elimina il rischio di neurotossicità dall’adesivo, nonché eventuali scostamenti di planarità a causa di spessore non uniforme dello strato adesivo.
Multi-elettrodo matrici sono comunemente usate negli esperimenti con hiPSCNs per valutarne la maturità e la funzionalità. Purtroppo, questi sistemi sono compatibili con questo modello perché il substrato di coltura delle cellule è rigido. È possibile creare un array di multi-elettrodi estensibile, anche se questo è finora solo stato dimostrato in un unico ben formato16,17. Si noti che i penetratori possono essere rimosso singolarmente dal blocco penetratore affinché alcuni pozzi non sono rientrate e possono servire come shams. Rimuovendo il penetratore impedisce il rientro ma non elimina completamente carico meccanico poiché non vi è ancora inerzia moto del fluido nei pozzetti durante la fase di spostamento. Vale la pena di confrontare questi pozzi per pozzi in piastre che erano mai soggetti a movimento di fase per misurare qualsiasi influenza patologica di movimento fluido. Inoltre, la matrice di penetratori nel blocco dovrebbe essere bisymmetric (simmetrico da davanti a dietro e di lato). Questa precauzione assicura che la piastra è caricata uniformemente durante il rientro, così che la fase non inclinare lateralmente e causare le aste da associare a loro cuscinetti.
Una delle principali sfide per l’innovazione terapeutica in neurotrauma è la complessità e l’eterogeneità della condizione. Trauma applica contemporaneamente lo stress multi-modale per ogni tipo di cellula nel sistema nervoso centrale. I neuroni sono stati generati in modo affidabile da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) e sono ora ampiamente disponibili da fornitori commerciali. L’innovazione sta procedendo rapidamente in questo campo, e altri tipi di cellule neurali come astrociti18 e microglia19 sono anche essere derivati da hiPSCs. Potrebbe presto essere possibile isolare le risposte delle cellule-autonoma di ciascuno di questi tipi di cellule per trauma in vitro e poi per tipi differenti delle cellule co-coltura per capire come comunicano dopo il trauma. In questo modo, in ultima analisi, è possibile ricreare la sfida clinica dal fondo a capire accuratamente in un sistema umano. Questo approccio è distinto dall’approccio convenzionale basandosi su modelli del roditore e ha il potenziale per generare nuove conoscenze che portano alle prime terapie per questa condizione comune, devastante e intrattabile.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto in parte da una sovvenzione del National Institutes of Health (R21NS098129). Vorremmo riconoscere eccellente assistenza tecnica da SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng e Feng Yuan Bu, che progettò e costruì una struttura per sostenere le luci utilizzate durante gli esperimenti di imaging ad alta velocità descritti in questo manoscritto .
Materials
| .010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
| Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
| Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
| Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
| Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
| Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
| Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
| Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
| High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
| LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
| LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
| FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
| Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
| Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
| 0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
| iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
| iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
| iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
| Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
| voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
| optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
| servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
| Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
| cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
| digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
| data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
| LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
| hiPSCNs | Cellular Dynamics International | ||
Referências
- Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. . Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).
- Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).
- Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).
- Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).
- Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).
- Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).
- Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).
- Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).
- Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).
- Kang, W. H., Morrison, B. Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).
- Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097 (2016).
- Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
- Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
- Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).
- Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).
- Yu, Z., Morrison, B. Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).
- Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
