Her presenterer vi en metode for en menneskelig i vitro modell av strekningen skade i 96-brønnen format på en tidsskala relevant å påvirke traumer. Dette omfatter metoder for fabrikasjon elastisk plater, Kvantifisere det mekanisk fornærmelse, dyrking og skadet celler, bildebehandling og høy innhold analyse å kvantifisere skade.
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en stor klinisk utfordring med høy sykelighet og dødelighet. Til tross for tiår med pre-klinisk forskning, er ingen bevist terapi for TBI utviklet. Dette dokumentet presenterer en ny metode for pre-klinisk Biografiske filmer forskning skal utfylle eksisterende pre-klinisk modeller. Introduserer det menneskelige Patofysiologien ved bruk av menneskelige indusert pluripotent Stamcelle-avledet neurons (hiPSCNs). Den oppnår lasting puls varighet lik lasting varighetene for klinisk lukket leder impact skade. Den sysselsetter en 96-brønns format som forenkler høy gjennomstrømning eksperimenter og gjør effektivt bruk av dyre celler og kultur reagenser. Silikon membraner er først behandlet for å fjerne nevrotoksiske uherdet polymer og deretter limt til kommersielle 96-brønns plate organer å skape elastisk 96-brønns plater. En spesialbygd enhet brukes til å rykke inn noen eller alle godt buksen fra under inducing equibiaxial mekanisk belastning at mekanisk skader celler i kulturen i brønnene. Forholdet mellom innrykk dybde og mekanisk belastning bestemmes empirisk bruker høyhastighets videography av godt bunner under innrykk. Cellene, inkludert hiPSCNs, kan kultivert på disse silikon membraner endrede versjoner av konvensjonelle celle kultur protokoller. Fluorescerende mikroskopiske bilder av cellekulturer er kjøpt og analysert etter skader på en semi-automatisert måte å måle nivået av skade i hver brønn. Modellen presentert er optimalisert for hiPSCNs, men kan i teorien brukes til andre celletyper.
TBI er en viktig årsak til dødelighet og sykelighet i USA, forårsaker rundt 52000 dødsfall og 275.000 sykehusinnleggelser hver år1. Mer enn 30 kliniske studier av kandidaten therapeutics for TBI har vært gjennomført uten suksessen2. Uniform feilen tyder på at menneske-spesifikke prosesser skille menneskelig TBI fra patofysiologi i brukte pre-klinisk gnager modeller.
Ankomsten av hiPSCNs har skapt en mulighet til å studere Biografiske filmer i en menneskelig i vitro modell. Narkotikarelaterte screening med hiPSCN-baserte modeller kan levere resultater som er mer intelligent klinisk suksess enn modeller ansette gnager celler. Også kan hiPSCNs være genetisk manipulert for å isolere og studere effekten av personlige menneskelige genetisk varianter på patologi3.
Metoden beskrevet i dette manuskriptet er utformet for å bringe unike fordelene hiPSCN-baserte sykdom modellering til Biografiske filmer. In vitro strekk skade modeller av Biografiske filmer er godt etablert4,5,6 primære gnager celler og menneskets nevrale kreftcelle linjer. De fleste av disse modellene generere strekning av pneumatisk lessing en silikon membran. Denne tilnærmingen er effektiv i ett godt format men har vist seg vanskelig å skalere opp til en multi godt format7. Som et resultat har det aldri vært en høy gjennomstrømning skjerm for agenter til å behandle strekk skadet neurons.
I denne modellen strekker membranen på grunn av innrykk fra under med en rigid indenter. Denne tilnærmingen har vist flere ganger å generere klinisk relevante patologi i vitro i enkelt godt systemer8,9,10. Våre siste arbeid har vist at det enkelt skaleres til en 96-brønns format samtidig opprettholde puls varigheter på titalls millisekunder11, som er tiden domenet lukket leder impact hendelser12,13.
Oppsummert er hovedfordelene med denne i vitro skade modellen 96-brønns format, bruk av hiPSCNs og klinisk relevante tiden domenet fornærmelse.
Nøkkelen til å få en konsekvent biofidelic fenotypen i denne modellen søker en konsekvent biofidelic mekanisk fornærmelse. Denne modellen kan generere puls varigheter så kort som 10-15 ms, ligner på puls varigheter for menneskelig hodet konsekvenser etter cadaveric eksperimenter12,13. Konsistensen av denne fornærmelse avhenger av justeringen av platen med indenter blokken og konsekvent smøring av indenters. Når indenter blokken justeres også, er det ingen trend i anvendt belastningen over rader eller kolonner (figur 2C). Et tynt lag av smøremiddel oppretter vanligvis mindre friksjon enn et tykt lag, og tyktflytende fett anbefales ikke fordi de foul silikon og forhindre passasje av lys under mikroskopi. Faktiske forskyvning amplituden kan falle betydelig kort foreskrevet forskyvning amplituden når mange indenters brukes, og foreskrevet scenen forskyvning amplituden er store (> 3 mm). Men mens den faktiske forskyvningen er mindre enn foreskrevet forskyvning på store amplituder, fortsatt det repeterbare (figur 2B). Derfor kan stor, faktiske forskyvninger amplituder pålitelig oppnås ved å angi en foreskrevet verdi over ønsket verdi. Forskyvning amplituden teller bare fordi det er en lett innspilte proxy for topp membran belastningen, som måler direkte mekanisk fornærmelse som induserer patologi. Fremgangsmåten for å fastslå membran belastningen fra scenen forskyvning er derfor kritisk. Denne prosessen må gjentas hvis noen store endringer i systemet som påvirker samspillet mellom platen og indenters, for eksempel hvis forskjellige diameter indenters, ulike indenter materialer eller belegg eller ulike typer silikon Bunn platen brukes. Personer indenter blokken og bestemme nullstillingen skal gjentas i begynnelsen av hvert eksperiment. En skjematisk strekker enheten vises i figur 1. CAD-modeller som kreves for å reprodusere enheten leveres som supplerende materiale: ‘ skade enheten – FULL montering – generisk 3D. TRINN ‘; tilknyttede stykklisten gitt somsupplerende tabell 1: Custom bygget enheter – BOM.xlsx. Se utfyllende tabell 2 96 godt Plate _loader – Pinout ledninger Diagram.xlsx, som beskriver kabelforbindelser som kobler forskjellige komponenter av systemer. ‘Interconnector_circuit_board.dip’ beskriver et kretskort som kobler kablene.
Hvis enheten deaktiveres med scenen nær midten av sin reise, flyttes scenen når strømmen er kuttet fordi det er fjærbelastet. Når strømmen er gjenopprettet, vil tilbakemeldinger oppdage en stor forskjell mellom den siste kjente foreskrevne posisjonen og den faktiske posisjonen. Dette fører til scenen for å flytte plutselig til stillingen som den var i da enheten ble deaktivert. Denne plutselige bevegelse kan forårsake feil i produksjonen av encoder, så forsiktighet bør utvises deaktivere enheten bare når det er i sin unpowered hviler posisjon på toppen av sin reise.
Fabrikasjon klemmen er utformet for å samle plate kropp og silikon nederst på en måte som gir optimale bånd. For dette formål, det er tre hoveddeler i design i filen supplerende ‘ Trykk dø – generisk 3D. TRINN ‘. Først er klemme plate kroppen holderen parallell silikon nederst. Hvis dette er riktig innebygd, vil det kreve ingen justering etter den første installasjonen. Andre, laget av skumplast i klemmen gir en liten mengde samsvar under plate, som et helt rigid system ville teoretisk erfaring en plutselig økning fra null lukkekraft til uendelig lukkekraft da klemmen ble lukket. Plasseringen av crossbar og festeskruen av klemmen justeres slik at avstanden mellom de to sidene av klemmen kan være finjustert.
Alt gjøres oppgi hvite bakgrunn bak dot godt nederst under belastning karakterisering eksperimenter. Jo bedre kontrasten i bildene, jo enklere blir det å automatisere prosessen å måle høyden og bredden av punktum, som kan bli kjedelig for en menneskelig operatør analysere et stort eksperiment. Høyhastighets videography av bunnen av en brønn i en 96-brønns plate presenterer utfordringer fordi veggene i brønnen pleier å kaste skygger. Bruk av en kuppel lys eller diffuse aksial lys som kan belyse langs siktlinje på kameraet uten skjule bildet eliminerer skygger eller speilende refleksjoner som ville oppstå med en konvensjonell lyskilde. Smarteste tilgjengelig lyskilden bør brukes fordi lys belysning lar bildene for å være kjøpt med en kort eksponeringstid. Kort eksponeringstider minimere bevegelse dimme. Oppgradering av lys emitting diodene (lys) i diffus aksial lys gir kortere eksponeringstider under høyhastighets video oppkjøpet. Lysdiodene kan oppgraderes ved å åpne diffus aksial lyset, fjerne aksjen lysdioder, montering 4 kraftkrevende LED matriser til ruten tilbake bruke lysdioder holdere, koble dem til en konstant gjeldende strømforsyning og remontere diffus aksial lyset (se tabell av Materialer for katalogfilene tall). Ulempen med å oppgradere lysdioder er at passivt avkjølt lysdioder ikke kan holdes mer enn et par sekunder på grunn av risiko for overoppheting. Derfor er et annet lys nødvendig for justering av etter kvartal og kameraet justeringen.
Presentert kvantifisere membran belastning ved å måle utvidelse av en prikk på membranen er relativt grov, men det kan skalere opp til flere brønner i en robust måte. Feltet belastning nederst godt kan være preget i detalj ved hjelp av digitalt bilde korrelasjon. Denne teknikken innebærer sprøyting en flekkete mønster på bunnen av brønnen og deretter imaging det på høyhastighets under deformasjon. Kommersiell programvare kan deretter brukes å kvantifisere belastning på hvert punkt i bildet ved å spore utviklingen av flekkete mønster.
Denne protokollen gir en mangesidig, klinisk relevante, strekke skade fenotypen i hiPSCNs. Celledød, neurite degenerasjon og neurite perler er alle godt dokumentert sekvele av TBI hos mennesker og dyr modeller15. Nøkkelen til suksess i denne modellen er å etablere og opprettholde sunne kulturer. Generelt, er en celle kultur protokoll utviklet med konvensjonelle stive platene verdt utgangspunkt for elastisk plate kultur. Imidlertid må alltid muligheten at cellene i spørsmålet kan reagere forskjellig på silikon vurderes. Dette gjelder særlig hiPSCNs, som er svært følsomme for oppdrettsforholdene. Noen eksempler på optimalisering celle tetthet og laminin konsentrasjon leveres i delen Representant resultater (Figur 3, Figur 4). Aktivering av silikon med plasma behandling er avgjørende. Silikon er hydrofobe og unreactive; i sin naturlige tilstand, vil det ikke bindes til laminin eller andre molekyler brukes til å fremme cellen vedlegg. Plasma behandling gjengir overflaten hydrofile og eksponerer reaktive grupper. Disse endringene kan vedheft molekyler å binde til silikon og fremme cellen vedlegg. Det er viktig å merke seg at plasma behandlingseffekt forsvinner innen minutter hvis overflaten er neddykket i væske, og så prosedyrer som involverer tørking aktivert overflaten skal utføres så raskt som mulig. En enkel måte å sjekke om effekten av plasma behandling har slitt av er å plassere en dråpe vann på overflaten. På ubehandlet silikon, vil slippverktøyet perle opp mens på plasma behandlet silikon, vil det spre seg. Med hiPSCNs som vi brukte (se Tabell for materiale), produsenten at laminin med cellen suspensjon i stedet for pre belegg. Denne protokollen har innlemmet denne tilnærmingen vellykket. Mens segmentering kan i teorien være dyktig med åpen kildekode eller generell programmeringsspråk, er en høy grad av kompetanse med disse verktøyene nødvendig for å oppnå gode resultater. Neurites er ofte vanskelig å skille fra bakgrunnen signalet fordi de er så slank. Derfor anbefaler vi bruk av kommersiell programvareverktøy distribuert av høy innhold mikroskopi firmaer med plikttro moduler for segmentering og kvantifisering av neurons, hvis de er tilgjengelige. Selv med kommersiell programvare er det lurt å eksportere bilder av segmentering visuelt bekrefte nøyaktigheten.
Det er noen begrensninger forbundet med å arbeide i elastisk plater sammenlignet med å arbeide med konvensjonelle, stive platene. Elastisk plater kan avbildes som normalt med luft mål. Bildebehandling med nedsenking mål er imidlertid svært vanskelig. Linsen olje kan skade silikon. I tillegg utøver målet press på silikon membranen som den beveger seg oppover. Dette presset fortrenger membranen vertikalt, gjør det vanskelig å bringe prøven i fokus. Silikon membraner som brukes i fabrikere platene er ca 250 µm tykk. Denne tykkelsen overskrider fokus avstand mange høy effekt, nedsenking mål. Særskilt omsorg må tas å legge membraner helt flatt før du klemmer fast for å oppnå flat kreves for mikroskopi. Autofokus kan kompensere for avvik i flat ferdig plate til en viss grad. Fremtidige versjoner av protokollen kan pre spenning membranen før det er limt til platen toppen å sikre flathet. Lim-fri prosedyren for liming silikon membranen plate topp14 er ansett som en viktig styrke av gjeldende protokollen. Det eliminerer risikoen for nevrotoksisitet fra limet samt alle avvik i flat på grunn av ikke-uniform tykkelsen på lim laget.
Flere elektrode matriser brukes ofte i eksperimenter med hiPSCNs for å vurdere deres modenhet og funksjonalitet. Dessverre, disse systemene er inkompatible med denne modellen fordi cellen kultur underlaget er stiv. Det er mulig å opprette en elastisk multi elektrode matrise, selv om dette har så langt bare vist i en enkelt godt format16,17. Merk at indenters kan fjernes enkeltvis fra indenter blokken slik at noen ikke er rykket inn og kan tjene som shams. Fjerne indenter hindrer innrykk men eliminerer ikke helt mekanisk laste siden det er fortsatt treghet bevegelse av væske i brønnene mens scenen er i bevegelse. Det er verdt å sammenligne disse brønnene brønner i plater som ble aldri utsatt scenen bevegelse å måle noen patologiske innflytelse fra flytende bevegelse. Også skal en rekke indenters i blokken bisymmetric (symmetrisk fra foran til bak og side til side). Denne forholdsregelen sikrer at platen er jevnt lastet under innrykk, slik at scenen ikke vippe sidelengs og forårsake stenger binde i deres kulelager.
En av de største utfordringene til terapeutisk innovasjon i biografiske filmer er kompleksiteten og heterogenitet av tilstanden. Traumer gjelder multimodal stress hver celle i sentralnervesystemet samtidig. Neurons er pålitelig generert fra menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) og er nå tilgjengelig fra kommersielle leverandører. Innovasjon går raskt i dette feltet, og andre nevrale celletyper som astrocyttene18 og microglia19 er også være avledet fra hiPSCs. Det kan snart bli mulig å isolere celle autonome responsen av hver av disse celletyper traumer i vitro og deretter co kultur forskjellige celletyper å forstå hvordan de kommuniserer etter traumer. På denne måten, kan det til slutt være mulig å gjenskape klinisk utfordringen fra bunnen opp til grundig forstå den i et menneskelig system. Denne tilnærmingen er forskjellig fra konvensjonelle tilnærming stole på gnager modeller og har potensial til å generere romanen innsikt som fører til de første behandling for denne felles, ødeleggende og vanskelige tilstanden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes delvis av et stipend fra National Institutes of Health (R21NS098129). Vi ønsker å erkjenne utmerket kundestøtte fra SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng og Feng Yuan Bu, som designet og bygget en struktur for å støtte lys brukes under høyhastighets tenkelig eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet .
.010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
(3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
hiPSCNs | Cellular Dynamics International |