Her præsenterer vi en metode for en menneskelig in vitro- model af stretch skade i 96-brønds format på en tidsskala, der er relevante for indflydelse traumer. Dette inkluderer metoder til opdigte elastisk plader, kvantificere den mekaniske fornærmelse, dyrkning og sårede celler, billedbehandling, og høj indholdsanalyse at kvantificere skade.
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en store klinisk udfordring med høj sygelighed og dødelighed. Trods årtiers præ-klinisk forskning, er ingen dokumenterede behandlinger til TBI blevet udviklet. Dette paper præsenterer en roman metode til præ-klinisk neurotrauma forskning til formål at supplere eksisterende prækliniske modeller. Det introducerer human Patofysiologi ved hjælp af menneskelige inducerede pluripotente stamceller-afledt neuroner (hiPSCNs). Det opnår lastning puls varighed svarer til lastning varigheder af kliniske lukket hovedet effekt skade. Det beskæftiger en 96-brønds format, der letter høj overførselshastighed eksperimenter og gør effektiv brug af dyre celler og kultur reagenser. Silikone membraner er først behandlet for at fjerne neurotoksiske uhærdet polymer og derefter bundet til kommercielle 96-brønd plade organer til at oprette elastisk 96-brønd plader. En specialbyggede enhed bruges til at indrykke nogle eller alle af de godt destillationsremanenser fra under inducerende equibiaxial mekanisk belastning, der mekanisk skader cellerne i kulturen i brøndene. Forholdet mellem indrykningen dybde og mekanisk belastning bestemmes empirisk ved hjælp af højhastigheds videography af godt bunde under indrykning. Celler, herunder hiPSCNs, kan blive kulturperler på disse silikone membraner modificerede versioner af konventionel celle kultur protokoller. Fluorescerende mikroskopiske billeder af cellekulturer er erhvervet og analyseres efter skade i en semi-automatisk mode at kvantificere skade i hver brønd. Modellen præsenteres er optimeret til hiPSCNs men kunne i teorien anvendes til andre celletyper.
TBI er en væsentlig årsag til dødelighed og sygelighed i USA, forårsager omkring 52.000 dødsfald og 275.000 hospitalsindlæggelser hvert år1. Mere end 30 kliniske forsøg af kandidat therapeutics for TBI er blevet gennemført uden en eneste succes2. Denne ensartede fejl tyder på, at menneske-specifikke processer separate menneskelige TBI fra Patofysiologi observeret i almindeligt anvendte prækliniske gnavere modeller.
Fremkomsten af hiPSCNs har skabt en mulighed for at studere neurotrauma i menneskelige in vitro- model. Stof screening med hiPSCN-baserede modeller kan levere resultater, der er mere intelligent af kliniske succes end modeller beskæftiger gnaver celler. Også, hiPSCNs kan være genetisk manipuleret til at isolere og studere effekten af individuelle menneskers genetiske varianter på patologi3.
Metoden i dette håndskrift er designet til at bringe de unikke fordele ved hiPSCN-baserede sygdom modellering til neurotrauma. In vitro stretch skade modeller af neurotrauma er veletableret4,5,6 med primære gnaver celler og menneskelige neurale kræft cellelinjer. De fleste af disse modeller generere strækning ved pneumatisk lastning en silicone membran. Denne fremgangsmåde er effektiv i et enkelt godt format men har vist sig vanskeligt at skalere op til en multi godt format7. Som et resultat, har der aldrig været en høj overførselshastighed skærm for agenter til at behandle stretch sårede neuroner.
I denne model, membranen strækker sig på grund af indrykning fra undersiden med en stiv indenter. Denne tilgang har vist gentagne gange til at generere klinisk relevant patologi i vitro i enkelt godt systemer8,9,10. Vores seneste arbejde har vist, at det nemt kan skaleres til en 96-brønds format samtidig opretholde puls varigheder på rækkefølgen af snesevis af millisekunder11, hvilket er den tid domæne af lukket hovedet indvirkning begivenheder12,13.
Sammenfattende er de vigtigste fordele ved denne in vitro- skade model 96-brønds format, anvendelse af hiPSCNs og klinisk relevante tid domæne af fornærmelsen.
Nøglen til at opnå en konsekvent biofidelic fænotype i denne model er at anvende en konsistent biofidelic mekaniske fornærmelse. Denne model kan generere puls varigheder så kort som 10-15 ms, der svarer til pulse varigheder for menneskers hoved virkninger ifølge dødt eksperimenter12,13. Konsekvens af denne fornærmelse afhænger af justeringen af pladen med indenter blokken og konsekvent smøring af indenters. Ved indenter blok er godt afstemt, er der ingen tendens i den anvendte stamme på tværs af rækker eller kolonner (figur 2 c). Et tyndt lag af smøremiddel typisk skaber mindre friktion end et tykt lag, og tyktflydende fedt anbefales ikke, fordi de foul silikone og hindrer passage af lys under mikroskopi. Faktiske fase forskydning amplitude kan falde væsentligt mindre end de foreskrevne forskydning amplitude når mange indenters anvendes, og foreskrevne fase forskydning amplitude er stort (> 3 mm). Mens den faktiske deplacement er mindre end den foreskrevne forskydning på store amplituder, er det imidlertid gentagelig (figur 2B). Derfor fås stor, faktisk forskydninger amplituder pålideligt ved at indtaste en foreskrevne værdi overstiger den ønskede værdi. Forskydning amplitude spørgsmål kun fordi det er en let indspillet proxy for peak membran stamme, som direkte måler den mekaniske fornærmelse, der inducerer patologi. Fremgangsmåden for bestemmelse af membran stamme fra fase forskydning er derfor kritisk. Denne proces skal gentages, hvis nogen større ændringer til systemet, der påvirker samspillet mellem pladen og indenters, for eksempel hvis forskellig diameter indenters, forskellige indenter materialer eller belægninger eller forskellige typer af silikone bund plade der bruges. Processen med omlægningen indenter blok og nul positioneringen skal gentages ved starten af hvert forsøg. En skematisk af stretching enheden er vist i figur 1. CAD modeller kræves for at gengive enheden leveres som supplerende materialer: ‘ skade enhed – fuld montage – generiske 3D. TRIN ‘; den tilknyttede stykliste leveres somsupplerende tabel 1: Custom bygget enheder – BOM.xlsx. Se også supplerende tabel 2 96 godt plade _loader – Pinout ledninger Diagram.xlsx, som beskriver de kabler forbindelser, der forbinder forskellige komponenter af systemerne. ‘Interconnector_circuit_board.dip’ beskriver et kredsløb, der forbinder kablerne.
Hvis enheden deaktiveres med fase nær midten af sine rejser, vil scenen flytte efter magt er afskåret, fordi det er fjederbelastet. Når strømmen er genoprettet, vil feedback-sløjfe opdager en stor forskel mellem den sidste kendte foreskrevne position og den faktiske position. Dette vil forårsage scenen for at flytte pludselig til positionen den havde, da enheden blev deaktiveret. Denne pludselige bevægelse kan forårsage fejl i produktionen af encoder, så skal sørges for at deaktivere enheden kun når det hviler i sin uden strøm position på toppen af sin rejse.
Fabrikation klemmen er designet til at bringe plade krop og silikone bunden sammen på en måde, der giver mulighed for optimal limning. Med henblik herpå, der er tre vigtige elementer i design præsenteres i den supplerende fil ‘ presse dø – generiske 3D. SKRIDT ‘. Først, klemme plade krop indehaveren er parallel med silikone bunden. Hvis dette er korrekt bygget, vil det kræve nogen tilpasning efter den første installation. Det andet giver lag af skum gummi i klemme en lille mængde af overholdelse under pladen, som en fuldstændig ufleksibelt system ville teoretisk oplever en pludselig stigning fra nul lukketryk til uendelig lukketryk, når klemmen blev lukket. Placeringen af overliggeren og sætskruen af klemmen er justerbar, så afstanden mellem de to sider af klemmen kan finjusteres.
Være bør gjort alt for at give en lys, hvid baggrund bag prik på godt bunden under stamme karakterisering eksperimenter. Jo bedre kontrast i disse billeder, jo lettere bliver det at automatisere processen med måling af højde og bredde af den prik, som kan blive trættende for en menneskelige operatør analysere et stort eksperiment. High-Speed videography af bunden af en brønd i en 96-brønd plade præsenterer udfordringer, fordi væggene i brønden har tendens til at kaste skygger. Brugen af en kuppel lys eller diffuse aksial lys, der kan belyse langs synsvidde af kameraet uden at tilsløre billedet eliminerer skygger eller spejlende refleksioner, der ville opstå med en konventionel lyskilde. Den klogeste tilgængelige lyskilde bør anvendes fordi lyse belysning giver mulighed for billeder, der erhverves med en kort eksponeringstid. Korte eksponeringstider minimere Bevægelsessløring. Opgradering af lysdioder (led) i den diffuse aksial lys giver kortere eksponeringstider under high-speed video erhvervelse. Lysdioder kan opgraderes ved at åbne den diffuse aksial lys, at fjerne lager lysdioder, montering 4 høj effekt LED arrays til ruden tilbage ved hjælp af lysdioder indehavere, forbinde dem til en konstant nuværende strømforsyning og ompakke den diffuse aksial lys (Se tabel af Materialer for katalog numre). Ulempen ved opgradering af lysdioder er, at de passivt kølet lysdioder ikke kan holdes mere end et par sekunder på grund af risikoen for overophedning. Derfor er et andet lys nødvendig for tilpasningen af justeringen efter blok og kamera.
Metoden præsenteres af kvantificere membran stamme ved at måle dilatation af en prik stemplet på membranen er forholdsvis rå, men det kan skalere op til flere brønde på en robust måde. Feltet stamme godt nederst på tværs kan karakteriseres mere detaljeret ved hjælp af digital billed korrelation. Denne teknik indebærer sprøjtning en plettet mønster på soklen af brønden og derefter imaging det på højhastighedstog under deformation. Kommerciel software kan derefter bruges til at kvantificere stamme på hvert punkt i billedet ved at spore udviklingen af den plettet mønster.
Denne protokol producerer en mangesidet, klinisk relevante, stretch skade fænotype i hiPSCNs. Celledød, neurite degeneration og neurite vulst er alle veldokumenterede sequelae af TBI hos mennesker og dyr modeller15. Nøglen til succes i denne model etablere og opretholde sunde kulturer. Generelt, er en celle kultur protokol udviklet med konventionelle stive plader et værdifuldt udgangspunkt for elastisk plade kultur. Muligheden for, at de pågældende celler reagerer forskelligt på silikone skal dog altid overvejes. Dette gælder især for hiPSCNs, som er meget følsomme over for kultur betingelser. Nogle eksempler for at optimere celle tæthed og laminin koncentration leveres i afsnittet Repræsentant resultater (figur 3, figur 4). Aktivering af silikone med plasma behandling er afgørende. Silikone er hydrofobe og ureaktivt; i sin naturlige tilstand, vil det ikke binde sig til laminin eller andre molekyler, der bruges til at fremme celle vedhæftet fil. Plasma behandling gør overfladen hydrofile og udsætter reaktive grupper. Disse ændringer tillader adhæsionsmolekyler at binde sig til silikone og fremme celle vedhæftet fil. Det er vigtigt at bemærke, at plasma behandling effekt forsvinder inden for få minutter, medmindre overfladen er nedsænkes i væske, og så procedurer, der involverer tørring aktiveret overfladen bør udføres så hurtigt som muligt. En enkel måde at kontrollere, hvis effekten af plasma behandling har slidt off er at placere en dråbe vand på overfladen. På ubehandlet silikone, vil slipværktøjet perle op på plasma behandlet silikone, vil det spredes. Med den hiPSCNs, som vi brugte (Se Tabel af materialer), producenten anbefaler tilføje laminin med cellesuspension snarere end før belægning. Denne protokol har indarbejdet denne fremgangsmåde med succes. Mens segmentering opnås i teorien, med open source-software eller generelle formål programmeringssprog, kræves en høj grad af færdighed med disse værktøjer til at opnå gode resultater. Neurites er ofte vanskelige at skelne fra baggrunden signal, fordi de er så slank. Vi anbefaler derfor, brugen af kommercielle software-værktøjer, der distribueres af høje indhold mikroskopi virksomheder med dedikeret moduler til segmentering og kvantificering af neuroner, hvis de er tilgængelige. Selv med kommerciel software er det klogt at eksportere billeder af segmentering visuelt kontrollere nøjagtigheden.
Der er nogle begrænsninger i forbindelse med arbejde i strækbart plader i forhold til at arbejde med konventionelle, stive plader. Elastisk plader kan være afbildet som normalt med air målene. Billedbehandling med fordybelse mål er imidlertid meget vanskeligt. Linse olie kan beskadige silikone. Derudover udøver formålet pres på silikone membran som den bevæger sig opad. Dette pres fortrænger membranen lodret, hvilket gør det vanskeligt at bringe prøven i fokus. Silikone membraner i øjeblikket anvendes i opdigte pladerne er ca 250 µm tykt. Denne tykkelse overstiger brændvidde på mange høj effekt, fordybelse mål. Særlig forsigtig skal træffes at lægge membraner perfekt flad før kassetten for at opnå fladhed kræves til mikroskopi. Autofokus systemer kan kompensere for afvigelser i fladhed af den færdige plade til en vis grad. Fremtidige versioner af protokollen kan pre spænding membranen, før det er bundet til plade toppen at sikre planhed. Lim-fri proceduren for limning silikone membran plade top14 betragtes som en vigtig styrke af den aktuelle protokol. Det eliminerer risikoen for neurotoksicitet fra limen samt eventuelle afvigelser i fladhed på grund af ikke-ensartet tykkelse af lag klæbestof.
Multi elektrode arrays er almindeligt anvendt i eksperimenter med hiPSCNs til at vurdere deres modenhed og funktionalitet. Desværre, disse systemer er uforenelige med denne model, fordi celle kultur substrat er stive. Det er muligt at oprette en elastisk multi elektrode-array, selv om dette er hidtil kun blevet påvist i et enkelt godt format16,17. Bemærk, at indenters kan fjernes enkeltvis fra indenter blok så nogle brønde ikke er indrykket og kan tjene som shams. At fjerne indenter forhindrer indrykning men helt fjerne ikke mekaniske lastning, da der stadig inertial bevægelse af væske i brøndene mens scenen er i bevægelse. Det er værd at sammenligne disse brønde brønde i plader, der blev aldrig udsat scene motion til at måle eventuelle patologiske indflydelse af flydende bevægelse. Også, bør vifte af indenters i blokken bisymmetric (symmetrisk fra front til bag og side til side). Denne forholdsregel sikrer, at pladen jævnt indlæses under indrykning, således at fase ikke vippe sidelæns og forårsage stænger til at binde i deres lejer.
En af de primære udfordringer til terapeutiske innovation i neurotrauma er den kompleksitet og heterogenitet af betingelsen. Traumer gælder multimodale stress til enhver celletype i centralnervesystemet samtidigt. Neuroner har været pålideligt genereret fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) og er nu bredt tilgængelige fra kommercielle leverandører. Innovation skrider hurtigt på dette område, og andre neurale celletyper såsom astrocytter18 og mikroglia19 afledes også af hiPSCs. Det kan snart være muligt at isolere de celle-selvstændig svar af hver af disse celletyper til traumer i vitro og derefter til fælles kultur forskellige celletyper til at forstå, hvordan de kommunikerer efter traumer. På denne måde, kan det i sidste ende være muligt at genskabe den kliniske udfordring fra bunden op til grundigt forstå det i et menneskeligt system. Denne tilgang adskiller sig fra den konventionelle tilgang bygger på gnavere modeller og har potentiale til at generere nye indsigter, der fører til de første behandlinger for denne fælles, ødelæggende og umedgørlig tilstand.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er delvist understøttet af et tilskud fra National Institutes of Health (R21NS098129). Vi vil gerne anerkende fremragende teknisk bistand fra SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng og Feng Yuan Bu, som er konstrueret og bygget en struktur til støtte for lys, der bruges under høj hastighed billedbehandling eksperimenter beskrevet i dette håndskrift .
.010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
(3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
hiPSCNs | Cellular Dynamics International |