염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.
우리는 성인 마우스 골격 근육, 구조 단백질의 높은 내용 가진 물리적으로 저항 조직에서에서 chromatin의 준비에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다. 성인 쥐에서 해 부 다리 근육은 육체적으로 기계 이동할 또는 닦지 세포 lysate의 포름알데히드 고정 하기 전에 당뇨 버퍼에 douncing의 조합에 의해 중단 됩니다. 고정된 핵 더 사이클 기계 이동할 또는 douncing 및 순차 filtrations 세포 파편을 제거 하 여 정화 됩니다. 순화 핵 동결 후 즉시 또는 나중에 무대에서 sonicated 수 수 있습니다. chromatin를 효율적으로 sonicated 수 있습니다 그리고는 프로필에서 볼 수 있듯이 chromatin immunoprecipitation 실험에 적합 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정에 대 한. 이 프로토콜에 의해 준비 하는 chromatin를 사용 하 여 검출 바인딩 이벤트는 주로 다른 섬유 관련 위성 및 내 피 세포에서 chromatin의 존재에도 불구 하 고 근육 섬유 핵에서 그. 이 프로토콜은 따라서 성인 쥐 골격 근육에 있는 유전자 규칙을 공부에 적응.
Chromatin immunoprecipitation (칩) 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 결합 하 고 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq) 전사를 공부 하는 선택의 방법 및 다양 한 조직에서 유전자 발현의 후 성적인 규정 되 그리고 세포 유형1. 이 기술은 화학식 chromatin 수정, 히스톤 변형 인, 및 녹음 방송 요인 바인딩2,3의 프로 파일링 게놈 넓은 수 있습니다.
배양된 세포에서 칩을 수행 하는 것이 잘 설립 동안 포유류 조직에서 칩 더 도전 남아 있다. Chromatin 칩에 대 한 준비 하 고 모든 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 하는 데 필요한 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. Chromatin는 경작된 한 세포의 세포 lysates 또는 그들의 핵의 다음 정화에서 준비 될 수 있습니다. 포유류 직물의 경우 효율적인 세포, 포름알데히드 고정, 그리고 핵의 정화는 chromatin의 복구를 보장 하기 위해 중요 하다. 또한, 그들의 정화 전후 핵 해결을 선택 실험적으로 결정 될 수 있다. 이러한 장애물에도 불구 하 고 칩은 간, 고환, 또는 뇌4,,56같은 조직에서 성공적으로 수행 되었습니다. 골격 근육의 경우 같은 물리적으로 저항 조직, 구조 단백질의 높은 콘텐츠 및 그것의 핵의 절연 전시 중단은 특히 도전적 이다. 이 특이성을 감안할 때, 다른 조직에 대 한 최적화 된 프로토콜 주지 않는다 만족 스러운 결과 골격 근육에 대 한.
여기는 칩-학년 chromatin 물리적 조직, 포름알데히드 고정, 그리고 핵 및 쥡니다의 방해를 포함 하는 마우스 골격 근육 조직에서 분리 하는 프로토콜에 설명 합니다. 염색 질이이 조직에서 적합 한 칩에 대 한 준비를이 방법의 효율성은 다양 한 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정7칩 정량 및 칩 seq를 수행 하 여 시연 했다.
이 새로운 기술은 이전에 보고 된 프로토콜8 시간, 녹음 방송 요인의 게놈 현지화에 변화 하는 동안 오래 콜라 소화 단계를 구성 보다 훨씬 빠른 고 유전자 발현에 변경 자리를 차지할 수 있습니다. 핵은 분리 하 고 고정 속도 여기에 설명 된 메서드를 특히 매력적인 chromatin 네이티브 게놈 인 상태를 더 충실 하 게 준비 하 게 만듭니다. 또한, 비록 근육 조직에서 chromatin 격리 또는 단백질 추출에 대 한 다른 방법 설명된8,,910 되었고 선택 된 유전자, 아니 칩 seq에 칩 정량 실험을 위해 사용 그들을 사용 하 여 데이터 보고 되었습니다. 여기 보고 메서드는 전사 인자와 히스톤 수정 칩 seq에 적합 하 고 따라서 또한 적합 해야한다 3/4 C 또는 HiC chromatin 구조 캡처 응용 프로그램.
여기는 성인 마우스 골격 근육이 염색이 질은 근육 섬유 핵 녹음 방송 요인 바인딩 및 화학식 히스톤 수정을 감지 칩 실험에 적합 표시에서 chromatin를 준비 하기 위한 새로운 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요 한 단계가 포함 됩니다. 첫 번째는 조직 장애 dounce 또는 기계적인 전단에 의해 수행 될 수 있는. 기계적 전단 빠르고 더 재현 이며 따라서 방법의 선택. 그럼에도 불구 ?…
The authors have nothing to disclose.
우리 감사 합니다 IGBMC 높은 처리량 시퀀싱 시설, “프랑스 Génomique” 컨소시엄 (ANR10-INBS-09-08)의 회원 및 모든 IGBMC 일반 서비스의 모든 직원 들은 특히 IGBMC 동물 시설 직원을. 이 작품은 CNRS는 INSERM, AFM, 국가 리그 죄수 르 암에서 교부 금에 의해 지원 되었다, 프랑스 프로그램 ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 표시 하는 Investissements d’Avenir에서 ANR 통해 펀드와 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. S.J 지원 했다 국가 리그 죄수 르 암과 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, V.U Ministère de l’Enseignement에 의해 동부 표준시 드 라 Recherche. ID는 ‘équipe labellisée’ 국가 리그 죄수 르 암입니다.
T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Additional items | |||
Scissors | |||
Loose Dounce | |||
15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
14 ml round bottom tubes | |||
1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |