Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı
Summary
Kromatin yetişkin fare iskelet kas kas lifleri gen düzenlemesi çalışmanın Kromatin immunoprecipitation tarafından uyarlanmış üzerinden hazırlanması için yeni bir protokol sunulmuştur.
Abstract
Biz Kromatin yetişkin fare iskelet kası, yapısal proteinler yüksek bir içerik ile fiziksel olarak dayanıklı bir doku üzerinden hazırlanması için verimli ve tekrarlanabilir bir protokol tanımlamak. Disseke bacak kasları yetişkin fareler üzerinden fiziksel olarak mekanik homojenizasyon veya kıyma ve douncing, önce formaldehit fiksasyon lysate hücrenin Hipotonik arabellekte bir arada tarafından bozulur. Sabit çekirdek mekanik homojenizasyon veya douncing ve hücre artıkları kaldırmak için sıralı filtrations daha fazla döngüleri tarafından saf. Arıtılmış çekirdeklerin hemen veya daha sonraki bir aşamada donma sonra sonicated. Kromatin verimli bir şekilde sonicated ve transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler için uygun Kromatin immunoprecipitation deneyleri için profilleri tarafından gösterildiği gibi elde edilir. Bu iletişim kuralı tarafından hazırlanan Kromatin kullanarak tespit bağlama olayları ağırlıklı olarak kas lif çekirdeği Kromatin fiber ilişkili diğer uydu ve endotel hücreleri varlığı rağmen meydana bunlar. Bu iletişim kuralı bu nedenle yetişkin fare iskelet kas gen düzenlemesi çalışmaya adapte.
Introduction
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kantitatif Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) birleştiğinde ve yüksek işlem hacmi sıralama (ChIP-seq) transkripsiyon çalışmaya seçim yöntemleri ve epigenetik gen ekspresyonu çeşitli dokularda düzenlenmesi olmuştur ve hücre-tip1. Bu teknik genom çapında kovalent Kromatin değişiklikler, Histon varyant doluluk ve transkripsiyon faktörü bağlama2,3profil oluşturma sağlar.
ChIP kültürlü hücrelerden performans iyi kurulmuş olmakla birlikte, küçük parça–dan memeli dokulara daha zor kalır. Kromatin küçük parça için hazırlanıyor her doku ve hücre türü için optimize edilmiş olması gereken birkaç kritik adımları içerir. Kromatin kültürlü hücre hücresel lysates veya kendi çekirdek aşağıdaki arıtma hazırlanabilir. Memeli dokular söz konusu olduğunda, verimli lizis, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri arıtma Kromatin en iyi kurtarma sağlamak için önemlidir. Ayrıca, deneysel olarak belirlenecek önce veya sonra kendi arıtma çekirdeklerin düzeltmek seçeneği vardır. Bu engellerin rağmen çip başarıyla karaciğer, testis veya beyin4,5,6gibi dokularda üzerinden yapıldı. İskelet kası durumunda bozulma dokusunun yapısal proteinlerin yüksek bir içerik ve izolasyon-in onun çekirdeği sergileyen böyle bir fiziksel olarak dayanıklı, özellikle zorlu ‘s. Bu özgüllüğü göz önüne alındığında, diğer dokular için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları tatmin edici sonuçlar iskelet kasları için vermeyin.
Burada ChIP-grade Kromatin fiziksel olarak doku, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri ve sonication yalıtım engellemeden içerir fare iskelet kas dokusundan izole etmek için bir protokol açıklayın. Kromatin bu dokudan küçük parça için uygun hazırlamak için bu yöntem verimliliğini çeşitli transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler7için ChIP-qPCR ve ChIP-seq gerçekleştirerek gösterilmiştir.
Bu yeni teknik uzun collagenase sindirim adımları hangi zaman, genomik transkripsiyon faktörleri lokalizasyonu değişimler sırasında oluşan bir daha önce raporlanmış protokolü8 ‘ den çok daha hızlı ve değişiklikler gen ifadesinin içinde yer alabilir. Hangi ile çekirdekleri izole ve sabit hız burada açıklanan yöntemi daha sadakatle yerli genomik doluluk durumu yakalar Kromatin hazırlamak özellikle cazip kılıyor. Ayrıca, Kromatin yalıtım veya protein kas dokusunun çıkarılması için diğer yöntemleri olmasına rağmen açıklanan8,9,10 edilmiş ve seçili genler, hiçbir çip seq üzerinde ChIP-qPCR deneyler için kullanılan veri bunları kullanarak rapor edildi. Rapor burada yöntem transkripsiyon faktörü ve Histon değişikliği için ChIP-seq uygundur ve bu nedenle de 3/4 C veya hıc Kromatin conformation yakalama uygulamaları için uygun olmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada Kromatin yetişkin fare iskelet kasları ve gösteri bu Kromatin transkripsiyon faktörü bağlama ve kovalent Histon değişiklikler kas lif çekirdeği tespit çip deneyleri için uygun hazırlanması için yeni bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı birkaç kritik adımları içerir. İlk dounce veya mekanik kesme tarafından gerçekleştirilen doku bozulma ‘s. Mekanik Kesme daha hızlı ve daha tekrarlanabilir ve bu nedenle yönteminin seçimi. Hiçbir uygun cihazı varsa, yine de, bozulma da douncing…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IGBMC yüksek işlem hacmi sıralama tesis, “Fransa Génomique” Konsorsiyumu (ANR10-INBS-09-08) bir üyesi ve tüm IGBMC genel Hizmetleri tüm personel özellikle IGBMC hayvan tesis personel teşekkür ediyoruz. Bu eser CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le kanser gelen hibe tarafından desteklenen, Fransız Fonu aracılığıyla ANR programı ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 etiketli Investissements d’Avenir altında devlet ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. S.J Ministère de l’Enseignement tarafından desteklenen Ligue Nationale contre le kanser ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 ve V.U tarafından et de la Recherche. Ligue Nationale contre le kanser bir ‘équipe labellisée’ kimliğidir.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
Referências
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
