우리는 합성에 대 한 프로토콜와 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 통합의 정화 수정 잔류물. 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법은 설명 합니다.
RNAs 중요 한 바이오 마커 및 치료 대상으로 떠오르고 있다. 따라서, 화학 프로브와 RNA 순서 및 구조의 인식에 대 한 치료 ligands 개발 잠재력이 있다. 화학적 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 최근 개발 된 시퀀스 별로 RNA duplexes 인식할 수 있는 수정. PNAs 중립 펩 티 드와 같은 등뼈와 화학적으로 안정 되어 있다. PNAs 수 수 합성 비교적 쉽게 수동 Boc 화학 단단한 단계 펩 티 드 합성 방법에 의해. PNAs 역 상 HPLC, 분자량 특성 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)에 의해 다음에 의해 정화 된다. 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 기술을 용이 하 게 세 겹 형성의 영상 때문에 신중 하 게 설계 된 무료 RNA 이중 구성 및 PNA 바인딩된 triplexes 자주 쇼 다른 마이그레이션 속도. Ethidium 평범한 사람 게시물 얼룩과 비 변성 시키기 페이지 종종 바인딩 친 화력 및 특이성 PNA 올리고의 특성화를 위한 쉽고 유익한 기술입니다. 일반적으로, 여러 개의 동 곳 RNA 또는 단 하나 기본적인 쌍 돌연변이와 duplexes 바인딩 친 화력 및 특이성 등의 PNA 바인딩 속성의 특성을 사용할 수 있습니다. 2 Aminopurine는 아데닌 (6-aminopurine);의 이성질체 2 aminopurine 형광 강도 지역 구조 환경 변화에 민감한 이며 PNA 바인딩 사이트 근처 통합 2 aminopurine 잔류물과 세 겹 형성의 모니터링에 적합. 2-Aminopurine 형광 적정 대상된 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)으로 수정된 PNAs 바인딩 선택도 단일 가닥 RNAs (ssRNAs)를 통해 확인 하도 사용할 수 있습니다. 자외선 흡 광도 감지 열 용융 실험 허용 PNA RNA duplexes와 PNA·의 열 안정성 측정 RNA2 triplexes입니다. 여기, 우리는 합성을 설명 하 고 PNA 올리고 통합의 정화 잔류물, 수정 하 고 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식의 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법을 설명.
RNAs는 중요 한 생체 및 규칙에서 RNAs의 역할의 발견과 다양 한 생물 학적 과정1,2,3의 촉매의 최근 발전으로 인해 치료 대상으로 등장 하고있다. 전통적으로, 센스 가닥 왓슨 크릭 이중 형성3,,45,6,7,8, ssRNAs 바인딩할 사용 되었습니다. 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. 최근, 펩 티 드 핵 산 세 겹 형성 (TFPNAs) Hoogsteen 수소 결합 (그림 1)3,,2829통해 dsRNAs 바인딩할 설계 되었습니다. dsRNA는 사전 mRNAs와 mRNAs, 사전 또는 pri miRNAs3, 그리고 많은 다른 비 코딩 RNAs1,,2627를 포함 하 여 전통적인 antisense 대상 RNAs의 대부분에 존재. TFPNAs를 사용 하 여 트리플 헬릭스 형성을 통해 dsRNAs 타겟팅의 구조 특이성 때문에 유리한 수 있습니다 고는 dysregulated 질병, 예를 들면 RNAs의 정상적인 기능을 복원에 사용 하기 위해 큰 잠재력입니다.
최근에 출판 된3,,2829,30,31,32,33, Rozners 그 외 여러분, 그리고 우리에 의해 작동 34,35,36,,3738,39,40,41, 개선에 노력을 보고 향상 된 선호도 dsRNAs 향해 수정된 TFPNAs의 선택적 바인딩. Thio-pseudoisocytosine (L) 단위체30 및 guanidine 수정 5-메 틸 시 토 신 (Q) 단위체31를 포함 하 여 합리적으로 설계 된 PNA 단위체 (그림 2)에 대 한 합성 방법을 개발 했습니다. 다양 한 생 화 확 및 생물 특성 방법을 통해 우리는 상대적으로 짧은 PNAs (6-10 잔류물) L과 Q 잔류물 통합 표시 왓슨 크릭 G-C와 C-G 기본적인 쌍의 향상 된 인식 각각 dsRNAs 설명 했다. PNAs L과 Q 잔류물을 포함 하는 또한, ssRNA 이상과 dsDNA dsRNA 향해 더 선택적 바인딩을 표시 수정 되지 않은 PNAs에 비해. Q 자료에 guanidine 기능42 PNAs를 HeLa 세포31입력을 수 있습니다.
우리의 실험실에서 우리는 PNAs 수동 Boc 화학에 의해 합성 (Boc 또는 t-Boc tert-butyloxycarbony에 대 한 서 ( 그림 2참조) 단단한 단계 펩 티 드 합성 방법4. Boc 그룹은 sterically 덜 PNA 모노 머 연결 하는 동안 도움이 될 수 있습니다 그룹을 보호 하는 fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) 아민에 비해 부피가 큰 그룹을 보호 하는 아민으로 Boc와 PNA 단량체의 합성은 편리 합니다 단단한 지원입니다. Boc 그룹 산 정한 이며 제거할 수 있습니다 쉽게 고체 지원에 dichloromethane (DCM)에 20-50 %trifluoroacetic 산 (TFA) PNA 합성 하는 동안. 자동된 펩타이드 합성기 PNA 올리고; 합성 채택 될 수 있다 그러나, 3 5 배 초과 PNA 단위체의 자동된 펩타이드 합성기 필요 합니다. 수동 합성 훨씬 적은 PNA 단위체를 (2-3-배 초과), 각 커플링 쉽게 카이 저 테스트43에 의해 모니터링이 필요 합니다. 또한, 많은 자동된 합성기 호환 되지 않습니다 부식성 TFA의 사용으로 인해 Boc 전략 합성 Boc 제거 단계.
PNA 올리고 역 상 고성능 액체 착 색 인쇄기 (라인란트-HPLC) MALDI TOF에 의해 분자량 특성 뒤에 의해 순화 될 수 있다 (그림 3 및 4)30, 31. 우리 고용 세 겹 형성 모니터링, 인해는 사실 무료 RNA 이중 구성 및 PNA 바인딩된 triplexes 종종 표시 다른 마이그레이션 속도 (그림 5)30,31 페이지 비 변성 시키기 . 효율적인 포스트 얼룩 RNA 이중 및 PNA· 둘 다를 위해 달성 될 수 있다 필요 없는 라벨 RNA2 트리플 밴드입니다. 비교적 적은 양의 샘플 페이지 실험 비 변성 시키기 위해 필요 하다. 그러나, 로드 (부 화) 버퍼 및 실행 버퍼 (pH 8.3) 않을 수 있습니다 같은, 비교적 높은 pH 8.3의 크게는 삼박자를 불안정 수 있습니다 때문에 접착 안정적인 triplexes 제한 되 고 측정 결과.
2 Aminopurine는 아데닌 (6-aminopurine);의 이성질체 2 aminopurine 형광 강도 (약 370에서 방출 피크 nm) 지역 구조 환경 변화에 민감한 이며 적합 한 바인딩 사이트 (PNA 근처 통합 트리 2 aminopurine 잔류물 형성의 모니터링에 대 한 그림 6) 31. 많은 다른 염료를 보이는 범위에서 형광 방출 쇼와 달리 2 aminopurine 표시 된 RNA 노출 될 수 있습니다 방에 빛 사진 표백 하지 않고. 페이지 실험 pH 8.3의 실행 버퍼 자주 필요 하다, 달리 2-aminopurine 기반으로 형광 적정 바인딩 지정된 pH에 1 개의 해결책에서 사용 하 고 따라서 측정 및 탐지의 상대적으로 약한 수 고 평형에 운동 불안정 바인딩입니다.
자외선 흡 광도 감지 열 용융 실험 허용 duplexes (그림 7)31 와 트라이의 열 안정성 측정플렉스30,32,,4445. 길이 시퀀스 구성에 따라 triplexes의 용 해 되거나 명확한 전환 표시 되지 않을 수 있습니다. 가 열 및 냉각 곡선 겹치면 열역학 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 등온선 적정 열 량 측정 (ITC)32; 여 정확한 열역학 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 그러나, 비교적 많은 양의 샘플은 ITC 일반적으로 필요 합니다.
RNA 이중 바인딩 PNA 올리고 (예를 들어, 10 메)는 중간 크기의 분자 그리고 따라서 표시할 수 있습니다 바인딩 시 전기 이동 기동성 교대 RNAs를 비교 또는 약간 더 큰 크기 (예를 들어, 50-메 르 또는 더 작은). RNA PNA 보다 상당히 큰 경우에, 제한 된 젤 기동성 교대 때문 RNA에 PNA의 적정 작동 하지 않을 수 있습니다. 따라서, 비 변성 시키기 페이지 분석 실험에 대 한 큰 RNA는 잘릴 수 있습니다. Fluorophore 표시 된 PNA에 큰 RNA의 적정 감시를 위한 세 겹 형성 비 변성 시키기 agarose 젤에 의해 젤40중간 로드 샘플 수 있습니다.
RNA의 일정 총 농도와 비 변성 시키기 페이지 적정 실험을 위해 우리는 일반적으로 효율적인 게시물 ethidium 평범한 사람에 의해 무료 RNA와 트리플 밴드의 얼룩에 대 한 1 µ M의 레이블이 RNA 농도 사용 합니다. RNA 농도 0.2 µ M로 낮은 RNA 구조31에 따라 충분 한 있을 수 있습니다. 레이블이 없는 RNA의 농도 (0.2 µ M)를 정확 하 게 측정 될 수 있다 Kd 값은 0.2 µ M에 대 한 또는 더 큰 이어야 합니다 결정 합니다. 다른 얼룩 염료 착 효율을 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 게시 되지 않은 데이터 Cy3 염료-표시 된 RNAs 꽉 바인딩 이벤트 측정 하 비 변성 시키기 페이지 실험에 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
사실은 2-aminopurine은 적당히 형광만, 2-aminopurine 형광 적정도 Kd 값 0.2 µ M31이상 가까이 바인딩의 측정에 제한 됩니다. RNA 또는 PNA 측정 형광 적정을 통해 솔루션에 상대적으로 꽉 바인딩 바인딩 변경 형광 신호53,54, 경우에 상대적으로 밝은 염료와 함께 표시 될 수 있습니다. 55.
DsRNA 바인딩 PNAs에 의해 RNA 구조를 대상으로 전략 RNAs의 제한 된 수에 대 한 테스트 되었습니다. 바인딩 속성 따라 달라질 수 있습니다 다른 시퀀스와 자료 쌍 작곡으로 dsRNAs 높습니다. 하나는 항상 TFPNAs의 디자인에 대 한 이중의 퓨 린 부유한 가닥을 선택할 수 있습니다. 어떻게 연속 Q·를 이해 하는 것이 중요 C G 세 배는 삼박자의 안정성에 영향을 수 있습니다. 더 광범위 한 시퀀스 종속 연구 명확 하 게 TFPNAs의 시퀀스 종속 바인딩 속성을 이해 하는 것 필요 합니다.
TFPNAs의 바인딩 선호도 길이 증가 및/또는 추가는 기초 및 백본56,57 TFPNAs의 수정 더 향상 될 수 있습니다. 그러나, 연속 이중 지역 수 있습니다 자주 구성 하지 중단 없이 10 개 이상의 연속 기본적인 쌍의 비 왓슨 크릭 구조에 의해. 하나 비 왓슨 크릭 구조 dsRNA 지역에 인접 한의 인식에 대 한 작은 분자와 TFPNAs 켤레 있습니다. 원칙적으로, TFPNA-작은 분자 공액 바인딩 친 화력과 특이성 TFPNA 또는 작은 분자 혼자에 비해 향상 예정입니다. 그러나,는 활용58,59,60,61,,6263,64에 대 한 링커의 화학 및 물리적 특성 최적화 해야 합니다.
TFPNAs 바인딩할 수 있는 선택적으로 dsRNAs ssRNAs와 dsDNAs는 사실 매우 유용한 화학 프로브 및 RNA 구조 역학 및 상호작용의 규칙을 통해 잠재적인 치료 ligands로 TFPNAs를 개발 하는 것을 제안합니다 단백질 그리고 대사 산물입니다. TFPNAs의 세포질 통풍 관 작은 분자, 펩 티 드, 등 나노 입자, 세포 관통 moieties로 활용 또는 리5,6 같은 supramolecular 구조 complexation을 통해 촉진 될 수 있습니다. ,12,17,25,31,41,,6566. 더 fluorophores 등 radioisotopes bioimaging 태그와 TFPNAs의 기능화 용이 하 게 하는 검색, 이미징, 및 살아있는 유기 체에서 기능 RNA 구조를 대상으로 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 싱가포르 교육 (MOE) 계층 1의 (RGT3/13 및 RG42/15 G.C.)와 모에 계층 2 (MOE2013-t 2-2-024 및 MOE2015-t 2-1-028 G.C.에)에 의해 지원 되었다.
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets | Alfa Aesar | 87956 | |
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) | Sigma-Aldrich | 532444 | |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Alfa Aesar | A11801 | |
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) | Alfa Aesar | B25251 | |
Acetic anhyride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
Kaiser Test Kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | |
Unmodified PNA monomers | ASM Research Chemicals GmbH | 5004007, 5004008, 5004009, 5004010 | |
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH | Sigma-Aldrich | B8389 / 47624 | |
Thioanisole | Alfa Aesar | A14846 | |
1,2-Ethanedithiol | Alfa Aesar | L12865 | |
Trifluoromethanesulfonic acid | Alfa Aesar | A10173 | |
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 | Merck Millipore | 150838 | |
RNA Oligos | Sigma-Aldrich | Customized | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | 39468 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Alfa Aesar | J15694 | |
HEPES | Lonza | 17-737E | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A8887 | |
N.N'-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-rad | 161-0700 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-rad | 161-0800 | |
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 | 1st Base | BUF-3010-10X1L | |
Glycerol | Promega | H5433 | |
Ethidium bromide (10 mg/mL) | Bio-rad | 161-0433 | |
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) | Hellma Analytics | 105.250-QS |