Wir berichten über die Protokolle für die Synthese und Reinigung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände. Die biochemischen und biophysikalischen Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs werden beschrieben.
RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele. So gibt es großes Potenzial bei der Entwicklung von chemischen Sonden und therapeutische Liganden für die Anerkennung der RNA-Sequenz und Struktur. Chemisch verändert Peptide Nucleic Acid (PNA) Oligomere vor kurzem entwickelt worden sind, die RNA-Maisonetten in einer Sequenz-spezifische Weise erkennen können. PNAs sind chemisch stabil mit einem neutralen Peptid-ähnliche-Backbone. PNAs können relativ leicht durch das manuelle Boc-Chemie Festphasen-Peptid-Synthese-Verfahren synthetisiert werden. PNAs sind durch Reverse-Phase-HPLC, gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-Zeit des Fluges (MALDI-TOF) gereinigt. Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Technik erleichtert die Bildgebung der triplex-Formation, da sorgfältig entworfen, freie RNA duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration raten. Non-Denaturierung Seite mit Interkalation Bromid Post Färbung ist oft eine einfache und informative Technik zur Charakterisierung der verbindlichen Affinitäten und Besonderheiten der PNA Oligomere. In der Regel mehrere RNA Haarnadeln oder Maisonetten mit einzigen Basenpaar Mutationen lässt sich PNA Bindeeigenschaften wie verbindliche Affinitäten und Besonderheiten charakterisieren. 2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); die 2-Aminopurine Fluoreszenz-Intensität ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung und eignet sich für die Überwachung der triplex Bildung mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA-Bindungsstelle aufgenommen. 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration kann auch verwendet werden, um die verbindliche Selektivität der modifizierten PNAs zur gezielten doppelsträngigen RNAs (DsRNAs) über einzelsträngigen RNAs (SsRNAs) zu bestätigen. UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität des PNA-RNA Maisonetten und PNA· RNA-2 -Triplexen. Hier beschreiben wir die Synthese und Reinigung von PNA Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände und biochemische und biophysikalische Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs beschreiben.
RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele, durch die jüngsten Fortschritte in der Entdeckungen der RNAs Rollen in der Verordnung und Katalyse von diversen biologischen Prozessen1,2,3. Traditionell wurden antisense Stränge zur Bindung an SsRNAs durch Watson-Crick duplex Bildung3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. vor kurzem Triplex-bildende Peptid-Nukleinsäuren (TFPNAs) wurden entwickelt, um DsRNAs über Hoogsteen Wasserstoffbindung (Abbildung 1)3,28,29binden. DsRNA Regionen befinden sich in den meisten der traditionellen Antisense-gezielte RNAs, einschließlich Pre-mRNAs und mRNAs, Pre oder Pri-MiRNAs3und viele andere nicht-kodierende RNAs1,26,27. DsRNAs durch Dreifachhelix Bildung mit TFPNAs Targeting kann aufgrund seiner Struktur Besonderheit vorteilhaft sein und ist mit großem Potenzial für den Einsatz bei der Wiederherstellung der normalen Funktionen der RNAs, die Dysregulated in Krankheiten, zum Beispiel.
Die kürzlich veröffentlichten Arbeiten von Rozners Et Al., und uns3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, berichtet die Bemühungen zur Verbesserung der die selektive Bindung von modifizierten TFPNAs in Richtung DsRNAs mit verstärkten Affinität. Wir haben Synthesemethoden für rational gestalteten PNA Monomere (Abbildung 2) einschließlich Thio-Pseudoisocytosine (L) Monomer30 und Guanidin-modifizierten 5-Methyl Cytosin (Q) Monomer31entwickelt. Durch verschiedene biochemische und biophysikalische Charakterisierungsmethoden haben wir gezeigt, dass relativ kurzen PNAs (6-10 Rückstände) Einbeziehung L und Q Rückstände verbesserte Erkennung von Watson-Crick-G-C- und C-G Basenpaaren, bzw. in DsRNAs zeigen. Darüber hinaus zeigen im Vergleich zu unveränderten PNAs, PNAs, die L und Q Rückstände enthalten mehr selektive Bindung in Richtung DsRNA SsRNA und DsDNA. Die Guanidin-Funktionalität-42 in der Q-Base ermöglicht PNAs HeLa Zellen31eingeben.
In unserem Labor zu synthetisieren wir PNAs durch manuellen Boc-Chemie (Boc oder t– Boc steht für Tert-Butyloxycarbony (siehe Abbildung 2) Festphasen-Peptid-Synthese Methode4. Die Synthese von PNA Monomer mit Boc als das Amin Gruppe zu schützen ist praktisch, da die Boc Group sterisch weniger sperrig im Vergleich zu Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin Schutz-Gruppe, die während der Kopplung ist auf PNA-Monomer kann vorteilhaft sein die solide Unterstützung. Die Boc Group ist Säure-labil und kann leicht auf die solide Unterstützung von 20-50 % Trifluoroacetic Säure (TFA) in Dichlormethan (DCM) während der PNA Synthese entfernt. Ein automatisierte Peptid-Synthesizer einsetzbar, PNA Oligomere zu synthetisieren; Allerdings braucht man 3-5-fach Übermaß an PNA Monomer für eine automatisierte Peptid-Synthesizer. Manuelle Synthese erfordert deutlich weniger PNA Monomer (2-3-Fach Selbstbehalt), mit jede Kupplung leicht von der Kaiser-Test43überwacht. Darüber hinaus sind viele automatisierte Synthesizer während der Boc-Schritt Entfernung nicht kompatibel mit der Boc-Strategie-Synthese durch den Einsatz von ätzenden TFA.
Die PNA-Oligomere können durch Reverse-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von MALDI-TOF gereinigt werden (Abbildungen 3 und 4)30, 31. beschäftigen wir nicht Denaturierung Seite triplex Bildung zu überwachen, dass freie RNA-Duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration Rate (Abbildung 5)30,31 . Keine Kennzeichnung ist erforderlich, wenn Post-effiziente Färbung für beide RNA duplex und PNA· erreicht werden kann RNS2 triplex Bands. Eine relativ kleine Menge der Probe ist für nicht-Denaturierung Seite Experimente erforderlich. Jedoch die Belastung (Inkubation) Puffer und die laufenden Puffer (pH 8,3) dasselbe, was in den Messungen wird beschränkt auf die kinetisch stabilen Triplexen, weil ein relativ hoher pH-Wert von 8,3 deutlich ein Triplex destabilisieren kann möglicherweise nicht.
2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); der 2-Aminopurine Fluoreszenzintensität (mit einer Emission Peak bei etwa 370 nm) ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung, und ist geeignet für die Überwachung der triplex Formation mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA Website (verbindlich aufgenommen Abbildung 6) 31. im Gegensatz zu vielen anderen Farbstoffen, die Fluoreszenzemission im sichtbaren Bereich zeigen, 2 Aminopurine beschriftet RNA kann ausgesetzt werden Raumlicht ohne Foto bleichen. Im Gegensatz zu Seite Experiment, in dem ein laufende Puffer pH 8,3 ist oft notwendig, 2-Aminopurine basierte Fluoreszenz Titration ermöglicht die Messung der Bindung in einer Lösung bei einem bestimmten pH-Wert, und so gestatten die Messung und Erfassung von relativ schwach und kinetisch instabil Bindung im Gleichgewicht.
UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität von Maisonetten (Abbildung 7)31 und triplexe30,32,44,45. Je nach Länge und Sequenz das Schmelzen des Triplexen kann oder kann nicht zeigen einen deutlichen Übergang. Thermodynamischen Parameter können erhalten werden, wenn die Heiz- und Kurven überlappen. Exakte thermodynamische Parameter erhalten Sie durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC)32; relativ große Mengen an Proben sind jedoch in der Regel erforderlich für ITC.
RNA Duplex-Bindung PNA Oligomere (z.B. 10-Mers) sind Moleküle, die mittlere und somit können zeigen elektrophoretische Mobilität Verschiebung auf verbindliche RNAs mit einer vergleichbar oder etwas größeren Größe (z. B., 50-Mer oder kleiner). Wenn eine RNA deutlich größer als die PNA ist, Titration von PNA in RNA funktioniert möglicherweise nicht aufgrund einer begrenzten Gel-Mobilität-Verschiebung. So kann die großen RNA für die nicht-Denaturierung Seite Assays abgeschnitten werden. Titration von eine große RNA in einem Fluorophore beschriftet PNA ermöglicht die Überwachung der triplex Bildung durch ein nicht denaturierenden Agarosegel mit der Probe in der Mitte der Gel40geladen.
Für eine Titration Experiment nicht Denaturierung seitenweise mit konstanter Gesamtkonzentration von RNS verwenden wir in der Regel eine unbeschriftete RNA-Konzentration von 1 µM für effiziente Post Färbung freie RNA und triplex Bands durch Interkalation Bromid. Eine RNA-Konzentration so niedrig wie 0,2 µM kann auch abhängig von der RNA Konstrukt31ausreichen. Die Konzentration der unbeschrifteten RNA (0,2 µM) bestimmt, dass die K–d -Werte, die genau gemessen werden können über 0,2 µM oder größer sein sollte. Andere Färbung Farbstoffe können verwendet werden, um die Färbung Effizienz zu erhöhen. Alternativ zufolge unsere unveröffentlichten Daten Cy3 Farbstoff-markierten RNAs in nicht Denaturierung Seite Experimente verwendet werden können, um die feste Bindung Ereignisse zu messen.
Die 2-Aminopurine nur mäßig Leuchtstoff ist, ist 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration auch beschränkt sich auf die Messung der Bindung mit K–d -Werte nahe oder über 0,2 µM31. Die RNA oder PNA kann mit einem relativ hellen Farbstoff zur Quantifizierung eine relativ enge Bindung in Lösung durch Fluoreszenz Titration, wenn die Bindung ergibt sich Änderungen in der Fluoreszenz Signale53,54, beschriftet werden 55.
Die Strategie des Zielens RNA-Strukturen durch DsRNA-Bindung PNAs wurde für eine begrenzte Anzahl von RNAs getestet. Es ist wahrscheinlich, dass bindende Eigenschaften für DsRNAs mit verschiedenen Sequenzen und Basenpaar Kompositionen variieren kann. Man kann immer die Purin-reiche Strang eines Duplex für die Gestaltung der TFPNAs wählen. Es ist wichtig zu verstehen, wie in Folge an C-G-Tripel können die Stabilität der ein Triplex beeinträchtigen. Umfangreichere Studien der reihenfolgeabhängigen sind klar zu verstehen, die reihenfolgeabhängigen Bindungseigenschaften des TFPNAs erforderlich.
Die Bindungsaffinität des TFPNAs kann durch Erhöhung der Länge und/oder weitere Basen und Backbones56,57 des TFPNAs ändern weiter gesteigert werden. Allerdings kann eine kontinuierliche duplex Region nicht oft von mehr als 10 aufeinanderfolgenden Basenpaaren ohne Störung durch nicht-Watson-Crick-Strukturen bestehen. Man kann TFPNAs mit kleinen Molekülen für die Anerkennung von nicht-Watson-Crick-Strukturen an DsRNA Regionen angrenzenden konjugieren. Im Prinzip soll ein TFPNA kleines Molekül Konjugat Bindungsaffinität und Spezifität im Vergleich zu einer TFPNA oder kleines Molekül allein verbessert haben. Jedoch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Linkers für die Konjugation58,59,60,61,62,63,64 muss optimiert werden.
Die Tatsache, dass TFPNAs selektiv, um DsRNAs über SsRNAs binden können und DsDNAs deutet darauf hin, dass es möglich ist, TFPNAs zu entwickeln, als sehr nützlich chemische Sonden und mögliche therapeutische Liganden durch die Regulierung der RNA Strukturdynamik und Interaktionen mit Proteinen und Metaboliten. Zelluläre Aufnahme von TFPNAs kann erleichtert werden, durch die Konjugation mit Zelle eindringen Moieties wie kleinen Molekülen, Peptiden, und Nanopartikel oder Komplexierung mit supramolekularen Strukturen wie Liposomen5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Weiter kann Funktionalisierung von TFPNAs mit Bioimaging Tags wie Fluorophore und Radioisotopen die Erkennung, imaging und Ausrichtung der funktionalen RNA-Strukturen in lebenden Organismen erleichtern.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Singapore Ministry of Education (MOE) Stufe 1 (RGT3/13 und RG42/15, g.c.) und MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 und MOE2015-T2-1-028, g.c.) unterstützt.
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets | Alfa Aesar | 87956 | |
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) | Sigma-Aldrich | 532444 | |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Alfa Aesar | A11801 | |
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) | Alfa Aesar | B25251 | |
Acetic anhyride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
Kaiser Test Kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | |
Unmodified PNA monomers | ASM Research Chemicals GmbH | 5004007, 5004008, 5004009, 5004010 | |
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH | Sigma-Aldrich | B8389 / 47624 | |
Thioanisole | Alfa Aesar | A14846 | |
1,2-Ethanedithiol | Alfa Aesar | L12865 | |
Trifluoromethanesulfonic acid | Alfa Aesar | A10173 | |
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 | Merck Millipore | 150838 | |
RNA Oligos | Sigma-Aldrich | Customized | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | 39468 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Alfa Aesar | J15694 | |
HEPES | Lonza | 17-737E | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A8887 | |
N.N'-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-rad | 161-0700 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-rad | 161-0800 | |
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 | 1st Base | BUF-3010-10X1L | |
Glycerol | Promega | H5433 | |
Ethidium bromide (10 mg/mL) | Bio-rad | 161-0433 | |
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) | Hellma Analytics | 105.250-QS |