Bir 2'-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü<em> Ç</em> Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar
Summary
Bu makale, C2'- O -konumunda modifiye edilmiş RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu hakkında ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. UV-vis ve dairesiz dikroizyum fotometrik analizleri yapısal yönleri, yani tek telli veya çift telli elektronları ölçmek ve karakterize etmek için kullanılır.
Abstract
Katı faz sentezi, çeşitli alanlardaki uygulamalar için ve farklı araştırma amaçları için popüler bir metodoloji haline getirmiştir, özellikle DNA veya RNA'dan oluşan, kanonik ve modifiye edilmiş nükleik asit polimerleri elde etmek için kullanılmıştır. Burada açıklanan prosedür, C2'- O -konumunda bulunan sıfır, bir veya iki modifikasyon ihtiva eden RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' dodekamerlerinin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu üzerine odaklanmaktadır. Problar, standart organik sentez yoluyla RNA nükleotitlerine dahil edilen ve ilgili fosforamiditleri vasıtasıyla karşılık gelen oligonükleotidlere dahil edilen 2-tiyofenilmetil gruplarına dayanmaktadır. Bu rapor, fosforamidit kimyasından, iki kanonik nükleobaz (Uridin (U), Sitozin (C), Guanozin (G), Adenosin (A)) ve aynı zamanda 2'- 0- konumunda modifiye edilmiş 2-tiyofenilmetil işlevselleştirilmiş nükleotidleri kullanmaktadır. pozisyon; Bununla birlikte, metodoloji büyük bir var için uygundurYıllar içinde geliştirilen değişiklikler. Oligonükleotidler, kontrollü gözenekli cam (CPG) desteğinde, ardından reçineden ayrılma ve standart koşullar altında korumanın bozulması, yani bir amonyak ve metilamin karışımı (AMA), bunu takiben hidrojen florür / trietilamin / N-metilpirolidinon kullanılarak sentezlendi. Karşılık gelen oligonükleotidler, poliakrilamid elektroforezi (% 20 denatürasyon) ile saflaştırılmış, akabinde eluyon, tuz giderme ve ters fazlı kromatografi (Sep-pak, C18 -kolon) yoluyla izole edilmiştir. Nicelik ve yapısal parametreler sırasıyla mor ötesi görünür (UV-vis) ve dairesel dikroizm (CD) fotometrik analizi ile değerlendirildi. Bu rapor, bu alana girmek isteyen yeni başlayanlar ve uzman araştırmacılar için bir kaynak ve rehber görevi görmeyi amaçlamaktadır. Yeni teknolojiler ve metodolojiler geliştirildiğinde ilerlemiş bir iş olarak hizmet etmesi bekleniyor. Bu metodolojilerin ve tekniklerin tanımıAdlı belge, fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisine (2013 yılında yenilenmiş ve satın alınmış) karşılık gelmektedir.
Introduction
DNA / RNA'nın oligonükleotidlerini elde etmek için katı-faz sentezi, 1970'lerden beri çeşitli alanlarda, birçok uygulamaya hizmet eden güçlü bir araçtır 1 , 2 , 3 fosforamidit yapı taşları 4 kullanarak. Geniş etki örnekleri şunlardır: etiketleme (tıklama kimyası reaksiyonları yoluyla ) 5 , yapısal sondalama 6 ve antisens teknolojileri 7'nin yanı sıra, biyolojik mekanizmaları 8 , 9 , genetik materyal olarak kaynakların aydınlatılması 10 ve burada kullanımı birçok others.The modifikasyon arasında çeşitli doğal ve / veya kimyasal modifikasyonlar 11, 12, ihtiva eden bir RNA oligonükleotid elde etmek için gerekli çabalarında ilk adımBu önemli biyopolimerin yapısını ve fonksiyonunu zamansal olarak kontrol edebilmek için fotoaktif sondalar.
Diziler ile RNA dodekamerleri sentezi: 5 '- [Cua CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [Ağustos AUU CCG UAG] -3' (altı çizili konumları C2'- O -thiophenylmethyl modifikasyonu dahil edilmesini temsil eder ) Bu çalışmanın odağını oluşturmaktadır. Diziler, RNA iplikçiklerinin tekli iplikçikler olarak veya bunların karşılık gelen dupleks yapıları olarak kantifikasyonunu ve ölçülmesini mümkün kılacak şekilde seçildi (diğer ikincil yapılar termodinamik olarak kararlı olarak tahmin edilmedi). Yapısal parametreleri, yani dupleks oluşumu ve termal denatürasyon geçişlerini oluşturmak için CD kullanıldı.
sentez
Bu oligonükleotidlerin elde edilmesine yönelik genel prosedür Şekil l' de gösterilmekte ve kademeli süreç izlemektedir: otomatik katı faz sentezi → DeprOteksiyon → Saflaştırma → Niceleme → Karakterizasyon. Şekil 2 , bu prosedürde gerekli olan monomerik birimleri göstermektedir. RNA katı faz sentezi (Şekil 2, sol) ve örneğin, G, A ve C, nükleofilik eksosiklik aminler için baz etkisiyle değişen koruma gruplarının kullanımı, fosforamidit kimyası dayandığını DNA benzerdir, Asetil, benzoil, fenoksiasetil, t -butil veya N , N- dimetilformamid ( Şekil 2 , sağda). C2'-OH grubunun (deoksoligonükleotid biyopolimerleri bulunmayan) varlığından dolayı RNA'da göz önüne alınması gereken bir diğer husus, bu nükleofilik konumun korunması ve daha sonra korumanın kaldırılması için eklenmesi gereken ek adımdır. Bu bağlamda, silikondan koruma grupları, biorthogonal kısımları (specificallHalkalı seçimler olarak tert -butildimetilsilil (TBDMS) ve triizopropilsililoksimetil (TOM) gruplarıyla ( Şekil 2 , sol alt) fluorür varlığında korumanın bozulması).
Bu çalışmada, otomatik sentez, standart fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisi üzerinde gerçekleştirildi. Cihaz üzerindeki üretici ayarları, fosforamiditlerin ticari versiyonlarını DNA için kullanırken otomatik seyreltme adımı veya kullanıcı tarafından ayarlanan hacimlerde seyreltme seçeneği içerir. Bununla birlikte, RNA fosforamiditini tartmaya ve elle seyreltmeye karar verdik: 1) RNA'nın kanonik fosforamiditlerinin fiyatı daha yüksek (bazı durumlarda 50 kat daha pahalı); 2) modifiye fosforamiditler genellikle küçük miktarlarda elde edilir; Ve 3) otomatik bir seyreltme basamağı (imalatçı tarafından belirlenmiş) kullanılarak atık malzeme miktarı büyüktür. Buna ilave olarak, 1) ticari olarak temin edilebilen katı destekler3'-uç olarak işlev görecek şekilde korunmuş bir nükleobaz içeren bir antikor ( örn. , CPG); Ve 2) C2'- O -konumunda bir TBDMS grubu ile korunan ticari fosforamiditler (kanonik nükleozazlar). Sentez adımlarının ayrıntılı listesi, Şekil 3 ve Tablo 1'de RNA sentezi için ayarlanmış adımlar için ilave açıklamalar ve yorumlar ile birlikte verilmektedir. Ayrıca, Şekil 4 , her bir detritilasyon adımından çıkan tritil katyonu nicelleştiren 'Trityl Monitor' seçeneğini seçtikten sonra her adım için gözlemlenen aşamalı verimleri göstermektedir.
Deneyimimizde, tipik olarak sınırlayıcı faktör, istenen modifikasyonu içeren fosforamiditin elde edilmesiydi. Yani, seçilen yerlerde modifikasyonların yapılmasına izin veren sentetik bir metodolojinin geliştirilmesi. Bu raporda,Karşılık gelen sentetik metodoloji olan C2'- O- tiyofenilmetil grubunu kurduğumuz, modifiye edilmiş bir nükleotidin dahil edilmesi. Bu grup, küçük boyutludur ve katı faz sentezini hiçbir şekilde etkilemez. Bu grubun, RNA oligonükleotidlerine dahil edilmesi, yapısal ve termodinamik parametreler 4 ile birlikte rapor edildiği için, burada, modifiye edilmiş fosforamiditlere yol açan organik sentezin hiçbir yönü tarif edilmeyecektir.
Korumanın Arındırılması ve Karakterizasyonu
Ekzosiklik aminlerin ve β-siyanoetil gruplarının korumasının bozulması, CPG-reçinesinden ayrılma ile aynı adımda gerçekleşir. Bu jel üzerinden ardından arıtma florür iyonu varlığında C2'- O -silil gruplarının ayrılması yolu ile ve ardından AMA sulu bir çözeltisi varlığında elde edilen reçinenin ısıtılması, yaygın olarak kullanılan koşullar, uygulamalı veElektroforez. Bu, birçok durumda, standart koşullar, daha yumuşak koşullar 13, 14, örneğin, metanol / potasyum karbonat (MeOH / K 2CO, 3'tür) veya bütilamin gerektirebilir bazik koşullar ya da florid iyonları ile kararsız olan modifikasyonlar haline iken. Dolayısıyla, karşılık gelen fosforamititlerin üzerinde farklı koruma grupları seti gereklidir. Ayrıca, bu yöntemle önceki tecrübelerimize ve diğer enstrümantasyon eksikliğine bakıldığında korumasız oligomerleri saflaştırmak için tercih edilen alternatif olarak elektroforezi seçtik. Bununla birlikte, HPLC etkili bir yöntem olarak alternatif olarak kullanılabilir 15 . Saflaştırılmış oligonükleotidlerin karakterizasyonu, 16 numaralı grubumuz tarafından bildirilen bir prosedür kullanılarak, kütle spektrometrisi, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonlaşma-uçuş süresi (MALDI-TOF) ile gerçekleştirildi.
Yapısal karakterizasyonu ve özellikleri Elde edilen dubleks mal stabilitesi CD üzerinden gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, CD'nin modifiye ve modifiye edilmemiş oligonükleotidlerinin termal denatürasyon geçişlerini belirlemek için CD'nin elastikiyetinde ca. 210 nm 'de bir λ max 270 nm, ve aynı zamanda (negatif elipslik) bandın kayboluşu. Hibridizasyon öncesi ve sonrası spektrum karşılaştırması, farklılıklarını göstermek ve kullanılan metodolojinin geçerliliğini sağlamak için verilmiştir. CD kullanımı, nükleik asitler ve aminoasitler 17'deki yapısal motiflerin belirlenmesinde yaygın olarak kabul görür ve bu nedenle çeşitli yapısal ve termodinamik parametreleri belirlemek için bir araç olarak kullanılabilir 18 ; Bununla birlikte, tekniğin termal denatürasyon geçişlerini değerlendirmek için kullanıldığı pek çok örnek bulunmamaktadır. Bazı örnekler, G-quadruplex'leri içeren DNA'daki termal kararlılıkların belirlenmesini içerirAss = "xref"> 19 , 20 veya RNA 21'in dubleksleri ve saç tokalarında.
Bu rapor, uzman olmayan okuyucuya veya görüntüleyen kişiye, bu tür bir araştırmaya sorunsuz başlamasını sağlayacak bir dizi araç sunmayı amaçlamaktadır. Bu heyecan verici bilim dalında yer alan diğer araştırma laboratuarlarındaki metodolojiler ve tekniklerle geliştirmek ve karşılaştırmak için hizmet edecektir. Bu rapordaki içerik, bu teknolojinin mevcut protokollerini çeşitli kaynaklardan ekler ve her basamak için görsel bir yardımla deneyimi zenginleştirir ve kolaylaştırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazısının amacı, DNA veya RNA'nın oligonükleotidlerinin sentezini başarılı bir şekilde elde etmek veya arttırmak için alan, acemi veya uzman araştırmacılarına rehberlik etmektir. Açıklanan metodoloji, standart fosforamidit kimyası yoluyla otomatik bir DNA / RNA sentezleyicisi kullanan katı faz sentezinin kullanımına odaklanmaktadır. Raporda, RNA dodecamerlerin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu adım adım anlatılıyor. Buna ek olarak, CD'nin kullanımı, ikincil yapı…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazının hazırlanması, Colorado Denver Üniversitesi'nden (JMRE) başlatılan fonlarla desteklendi. AF bir Araştırma ve Yaratıcı Etkinlikler ödülünün (RaCAS, CU Denver) desteğini kabul etmek istiyor. Colorado Denver Üniversitesi Araştırma Hizmetleri Ofisi'nden yayın masraflarını karşılamak üzere finanse edildi. Video bölümündeki katkıları için Bayan Cassandra Herbert ve Sayın Yannick K. Dzowo'ya laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
Referências
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2′-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified ‘ultra-mild’ DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2′-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA – a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses – A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2′-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. 14, 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -. L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. . RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, 45-80 (2010).
