Протокол твердофазного синтеза олигомеров РНК, содержащий 2'-<em> O</em> -тиофенилметильная модификация и характеризация с помощью циркулярного дихроизма

Твердофазный синтез для получения олигонуклеотидов ДНК / РНК является мощным инструментом, который обслуживал несколько приложений в различных областях с 1970-х годов ^{1 , 2 , 3} с использованием блоков ⁴ фосфорамидита. Примеры его широкого влияние включают в себя: его воздействие в маркировке ( с помощью химии нажмите реакции) ^5, структурного зондирующее ⁶ и антисмысловые технологии ^7, а также его выяснение биологических механизмов ^{8, 9,} источника в качестве генетического материала ^10, и изучение Различные природные и / или химические модификации ^{11 , 12} , среди многих других. Модификация, которую мы здесь используем, представляет собой первый шаг в наших усилиях по получению олигонуклеотидов РНК, которые содержатФотоактивные зонды для обеспечения временного контроля структуры и функции этого важного биополимера.

Синтез додекамеров РНК с последовательностями: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3' (подчеркнутые положения представляют собой включение C2'- O- тиофенилметильной модификации ) Составляет основное внимание в этом исследовании. Последовательности были выбраны так, чтобы обеспечить количественную оценку и измерение нитей РНК как одиночных цепей или их соответствующих дуплексных структур (никакие другие вторичные структуры не были предсказаны как термодинамически стабильные). CD был использован для установления структурных параметров, т. Е. Дуплексного образования и термических денатурационных переходов.

Синтез
Общая процедура получения этих олигонуклеотидов проиллюстрирована на рисунке 1 и следует поэтапному процессу: автоматизированный твердофазный синтез → DeprOtection → Очистка → Количественная оценка → Характеристика. На рисунке 2 показаны мономерные единицы, которые необходимы в этой процедуре. Твердофазный синтез РНК аналогичен твердофазному синтезу ДНК, поскольку он основан на химии фосфорамидитов ( рис. 2 , слева) и использовании базово-лабильных защитных групп для нуклеофильных экзоциклических аминов на G, A и C, например , Ацетил, бензоил, феноксиацетил, трет- бутил или N , N- диметилформамид ( фиг. 2 , справа). Еще один аспект, который следует учитывать в РНК из-за присутствия C2'-OH-группы (отсутствующей в дезоксиолигонуклеотидных биополимерах), является дополнительной стадией, которая должна быть включена для защиты и последующего снятия защиты с этой нуклеофильной позиции. В этом отношении защитные группы на основе кремния стали привлекательной стратегией из-за их потенциала как биортогональных фрагментов (specificallY сняли защиту в присутствии фторида), так как группы трет- бутилдиметилсилил (TBDMS) и триизопропилсилилоксиметил (TOM) являются популярными ( рис. 2 , внизу слева).

В этой работе автоматизированный синтез проводили на синтезаторе ДНК / РНК, который использует стандартную химию фосфорамидита. Настройки изготовителя на инструменте включают автоматическую стадию разбавления при использовании коммерческих версий фосфорамидитов для ДНК или возможность разбавления в объемах, заданных пользователем. Однако мы решили взвешивать РНК фосфорамидит и разбавлять вручную, учитывая, что: 1) цена канонических фосфорамидитов РНК выше (в некоторых случаях в 50 раз дороже); 2) модифицированные фосфорамидиты часто получают в небольших количествах; И 3) количество затраченного материала при использовании этапа автоматизированного разбавления (устанавливается изготовителем) является большим. Кроме того, мы использовали: 1) коммерчески доступные твердые опоры( Например , CPG), содержащую защищенную нуклеотидную основу, чтобы функционировать как 3'-конец; И 2) коммерческие фосфорамидиты (канонические нуклеотидные основания), защищенные группой TBDMS при C2'- O -позиции. Подробный перечень этапов синтеза представлен на рис. 3 и в таблице 1 вместе с дальнейшим описанием и комментариями для шагов, которые были скорректированы для синтеза РНК. Кроме того, на рисунке 4 показаны ступенчатые выходы, которые наблюдаются для каждого шага после выбора опции «Trityl Monitor», которая количественно оценивает тритильный катион, высвобождаемый с каждого этапа дебитиляции.

Стоит отметить, что, как нам показалось, лимитирующим фактором является получение фосфорамидита, содержащего требуемую модификацию. То есть, разработка синтетической методологии, которая позволяет вносить изменения в отдельные сайты. В этом отчете мы сосредоточим внимание наВведение модифицированного нуклеотида, для которого была установлена ​​соответствующая синтетическая методика, C2'- O- тиофенилметильная группа. Эта группа мала по размеру и никоим образом не влияет на твердофазный синтез. Поскольку сообщалось о включении этой группы в олигонуклеотиды РНК, наряду со структурными и термодинамическими параметрами ⁴ , здесь не будут описаны аспекты органического синтеза, приводящего к модифицированным фосфорамидитам.

Снятие защиты, очистка и характеристика
Снятие защиты с экзоциклических аминов и ß-цианоэтильных групп происходит на той же стадии, что и расщепление от CPG-смолы. Мы применили общеупотребительные условия нагревания полученной смолы в присутствии водного раствора АМА с последующим расщеплением C2'- O- силильных групп в присутствии ионов фторида и затем очисткой через гельэлектрофорез. Хотя во многих случаях они стали стандартными условиями, модификации, которые являются лабильными для основных условий или ионов фторида, могут потребовать более мягкие условия ^{13 , 14} , например , карбонат метанола / калия (MeOH / K ₂ CO ₃ ) или бутиламин. Таким образом, необходим другой набор защитных групп на соответствующих фосфорамидитах. Кроме того, мы выбрали электрофорез в качестве предпочтительной альтернативы очистке снятых защитных олигомеров, учитывая наш предыдущий опыт этого метода и отсутствие других инструментов. Однако ВЭЖХ можно альтернативно использовать в качестве эффективного метода ¹⁵ . Характеристика очищенных олигонуклеотидов проводилась с помощью масс-спектрометрии, лазерной десорбции / ионизации-времени полета (МАЛДИ-ТОФ) с матричной поддержкой, с использованием описанной процедуры нашей группой ¹⁶ .

Структурная характеристика и Устойчивость полученных дуплексов была выполнена с помощью CD. В частности, мы используем CD для определения температурных денатурационных переходов модифицированных и немодифицированных олигонуклеотидов РНК, следуя уменьшению эллиптичности полосы прибл. 270 нм, а также исчезновение полосы (с отрицательной эллиптичностью) с λ _max при 210 нм. Сравнение спектров до и после гибридизации предоставляется для иллюстрации их различий и обеспечения валидации применяемой методологии. Использование CD широко принимается при определении структурных мотивов в нуклеиновых кислотах и ​​аминокислотах ¹⁷ и поэтому может быть использовано в качестве инструмента для определения различных структурных и термодинамических параметров ¹⁸ ; Однако, существует мало примеров, где метод используется для оценки тепловых денатурационных переходов. Некоторые случаи включают определение термической стабильности на ДНК, содержащей G-квадруплексыAss = "xref"> 19 ^{, 20} или в дуплексах и шпильках РНК ²¹ .

Этот отчет предназначен для предоставления читателю или зрителю, не являющемуся экспертом, набором инструментов, которые позволят обеспечить плавный запуск этого типа исследований. Он будет способствовать усилению и сопоставлению с методологиями и методами в других исследовательских лабораториях, которые участвуют в этой увлекательной отрасли науки. Содержание в этом отчете добавляет к существующим протоколам этой технологии из разных источников и обогащает и облегчает опыт визуальной помощи для каждого шага.