Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Histon translasyonel modifikasyonlar doğrudan transkripsiyon, çoğaltma ve DNA onarım^1,2,3de dahil olmak üzere çeşitli Kromatin bağlı işlemlerde söz konusu. Ayrıca, farklı Histon değişiklikleri olumlu gösterir (Örneğin, H3K4me3 ve H3K27ac) veya negatif (Örneğin, H3K9me3 ve H3K27me3) gen ekspresyonu ile korelasyon ve genel olarak tanımlanabilir etkinleştirebilir veya baskıcı Histon işaretler gibi sırasıyla^2,3. Sonuç olarak, küresel Histon değişiklik haritalar, epigenomic haritalar, olarak da işlevsel olarak omurgalı genleri^4,5ek açıklama eklemek için güçlü ve evrensel araçlar ortaya çıkmıştır. Arttırıcılar tespit edilmesi gibi örneğin, distal düzenleyici dizileri belirli Kromatin imzalar varlığı dayalı (Örneğin, etkin arttırıcılar: H3K4me1 ve H3K27ac), hangi proksimal organizatörü bölgelerden onları ayırmak (Örneğin, etkin rehberleri: H3K4me3)^6,7,8. Öte yandan, genlerin büyük hücre kimlik düzenleyici fonksiyonları ile genellikle H3K4me3 H3K27me3, altta yatan genlerin transcriptionally etkin veya etkin olmayan durumuna bağlı olarak sırasıyla yine geniş Kromatin etki alanları ile^{9 bulunur ,10}. Benzer şekilde, büyük hücre kimlik genlerin ifade sık sık çoklu tarafından ve dağınık şekilde kontrol edilebilir için geniş H3K27ac işaretlenmiş etki alanları¹¹tanımlanabilir arttırıcılar (Yani, süper arttırıcılar), kümelenmiş gibi görünüyor.

Şu anda, Histon değişiklik haritalar sağlayan ChIP-yonga (ChIP microarrays için birleştiğinde) gibi önceki yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek çözünürlük, daha az eserler, daha az gürültü, daha fazla kapsama alanı ve alt ChIP-seq teknolojisi kullanılarak oluşturulan maliyeti¹². Yine de, ChIP-seq teknolojisini kullanarak epigenomic haritalar nesil çoğunlukla çip faiz örneklerinde başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için kapasite ile ilişkili doğasında kendi sınırlamaları vardır. Geleneksel çip protokolleri genellikle milyonlarca hücre hangi sınırı içinde in vitro hücre için bu yöntemin uygulanabilirliği hatları veya bu hücreler kolayca izole vivo içinde (Örneğin, kan hücreleri) olabilir, gerekli. Son birkaç yıl içinde bir dizi modifiye ChIP Protokolü düşük hücre sayıları ile uyumlu açıklanan^13,14,15,16olmuştur. Ancak, bu iletişim kuralları (Yani, ChIP-seq) yeni nesil sıralama ile birleştiğinde olabilir için özel olarak tasarlanmış ve genellikle özel Kütüphane hazırlama yöntemleri^13,14, kullanın ^{15 , 16}.

Burada, Histon değişiklik profilleri için ara düşük hücre sayıları (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ hücreleri) kullanarak araştırmak için kullanılan bir çip protokol açıklanan ya da seçili loci (Yani, ChIP-qPCR) veya genel olarak (Yani, Çip seq) (şekil 1). ChIP-seq teknoloji birleştiğinde, bizim çip Protokolü standart kitaplığı hazırlama yöntemleri, böylece birçok laboratuar¹⁰genel olarak erişilebilir yapmak ile birlikte kullanılabilir. Bu iletişim kuralı birkaç Histon işaretleri araştırmak için kullanılan (örneğin, H3K4me3, H3K27me3 ve H3K27ac) farklı tavuk embriyonik dokularda (Örneğin, spinal Nöral tüp (SNT), iyi çikinti ve epiblast). Ancak, biz genel olarak hangi biyolojik ve/veya klinik olarak ilgili örnekleri yalnızca düşük miktarlarda elde edilebilir diğer organizmalar için uygulanabilir olmalıdır tahmin.

Alman hayvan bakımı kurallarına göre kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) onay tavuk embriyo deneyler yerine getirilmesi. Yerel kurallarına göre yalnızca deneyler tavuk HH44 (18 gün) bebekleri ile ve eski IACUC onayı gerekir. Ancak, bu çalışmada kullanılan embriyolar tüm önceki embriyonik gelişim aşamalarında idi (Yani, HH19 (72 h)).

Not: etkin bir şekilde qPCR veya Histon değişiklikleri araştırmak için (Yani, ChIP-seq) yeni nesil sıralama ile birleştirilerek oluşturmaları çip tahlil ayrıntılı bir açıklama sağlamak için bu protokolü amacı mevcuttur düşük-bereket embriyonik örnekleri (5 x 10 ⁴ arasında değişen-5 x 10 ⁵ hücreler her çip tepki için) ve farklı doku türlerine ( şekil 1). Protokol transkripsiyon faktörleri ve ortak harekete geçirmek (Örneğin, p300) bağlama profilleri soruşturma için uygulanabilir olmalıdır. Ancak, bu düzenleyici proteinler düşük bolluğu nedeniyle, daha büyük hücre sayıları gerekli (5 x 10 ⁵ - 5 x 10 ⁶ hücreler her çip tepki için) olması muhtemeldir.

1. hazırlama yumurta ve tavuk SNT mikrodiseksiyon

Not: yordamı microdissections için teknik olarak dokuya dokusundan ve hayvan modeli için hayvan modeli farklıdır. Bu bölümde, diseksiyon protokolü kullanılan Brakiyal SNT bölümler sahne-HH19 tavuk bebekleri örnek olarak edinmek için ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

1. Verimli beyaz Livorno tavuk yumurta,--dan a yerel doğurmak, 37 ° C ve % 80 nem sahne-HH19 tavuk bebekleri almak 3 gün boyunca, yatay yönde elde kuluçkaya.
2. Aşamaları Hamburger ve Hamilton göre tavuk embriyonik gelişim hazırlama sistemi ¹⁷ belirlemek.
3. Tüm microdissections soğuk koşullarda gerçekleştirmek; aksi halde, Kromatin bütünlüğü tehlikeye.
4. HH19 embriyolar izole.
   1. Embriyo erişilebilir olması için blastoderm düşürmek için bir iğne (0,90 x 40 mm) ile 10 mL şırınga kullanarak albümin 3 mL ayıklamak.
   2. İyi makas kullanarak yumurta içinde küçük bir açılış yapmak ve 1 mL Locke çözeltisi ekleyin (tarif için Ek materyalleri görmek) ekstra embriyonik membranlar kaldırılmasını kolaylaştırmak için.
   3. % 10 Hint siyah mürekkep/Locke çözüm 1 mL şırınga embriyo görselleştirme kolaylaştırmak için blastoderm altında bir iğneyle (0,55 x 25 mm ²) kullanarak enjekte.
   4. Medikal Cerrahi iyi makas ve forseps kullanarak embriyo çevreleyen ekstra embriyonik membran kesti.
   5. 4,5 cm Petri kabına 20 mL 1 x PBS çözüm içeren embriyo transfer etmek için delikli kaşık kullan.
5. Uzak amnion ve ekstra embriyonik membran kullanarak iyi makas ve forseps bir stereomicroscope altında kalan bölümlerini teşrih.
6. Caudally ( Şekil 2) SNT yalıtmak için göğüs bölgesine uzanan embriyo, brakiyal düzeyde enine SNT segment kesti.
7. Kaldırmak yanal/ventrally (Örneğin, yan plaka mesoderm, ektoderm, notochord ve aort) SNT çevreleyen dokuların kullanarak forseps ( Şekil 2).
8. 3.5 cm Petri kabına 5 mL sıcak (37 ° C) tripsin (tripsin/EDTA çözüm 1:250) de içeren her disseke tavuk SNT segmentinde bırakın.
9. Durdurmak tripsin tedavi altında stereomicroscope SNT çevresinde sigara-nöro dokuları gevşeme algılandığında.
   Not: Trypsinization zaman sıkı bir şekilde aşırı sindirim ve sinir dokusu dağılım önlemek için ve SNT yapısal bütünlüğünü korumak için denetlenmelidir.
10. El ile temiz SNT kısmını hazırlamak için kalan Mezenkimal ve ektodermal doku tripsin tedavi sonrası kaldırmak.
11. 1.5 mL tüp SNT bölüm aktarmak ve flash-bu sıvı azot içinde dondurma. Bir kez yeterli SNT bölümler (birikmiş havuzu SNT bölümler ~ 30 tavuk bebekleri bir çip tepki için gelen), depolamak-80 ° C.
    Not: Eğer yeterli embriyonik doku (Yani, 5 x 10 ⁵-5 x 10 ⁶ hücreler) tek bir veya birkaç tavuk bebekleri, disseke sonra donma gerekli değildir ve doğrudan sonraki adımlara devam etmek mümkündür. Lütfen Tablo 1 ' deki sorun giderme kılavuzu'na başvurun.
    Not: dikkat! Sıvı nitrojen var bir son derece düşük sıcaklık, uygun koruma giymek.

2. Crosslinking proteinler DNA için: gün 1

Not: aksi belirtilmedikçe buza tüm adımları gerçekleştirin.

1. DMEM Ekle 500 µL % 10 ile FBS ve 1 M Na-bütrat donmuş doku için doğrudan 10 µL veya alternatif olarak, hemen taze disseke doku için. Hücreleri nazikçe 1 mL pipet ile yeniden askıya tarafından lunaparkçı.
   Not: Na-bütrat isteğe bağlıdır, ancak önerilen eklenmesidir Histon asetilasyon soruşturma eğer. DMEM - %10 FBS yerine örnekleri 1 x PBS % 0,1 BSA ile içinde resuspended. FBS veya BSA eklenmesi isteğe bağlıdır, ancak sonraki Santrifüjü adımları örneklerinde peletleme kolaylaştırır.
2. 13.5 µL % 37 formaldehit (%1 formaldehit final) ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında bir rotator yerleştirin.
   Not: dikkat! Formaldehit zehirli.
3. 2.5 M glisin 25 µL tüp ekleyip bir rotator formaldehit gidermek için oda sıcaklığında 10 dakika yerleştirin.
4. Tüp 850 x g masa üstü santrifüj 4 ° C'de 5 min için de spin. Süpernatant atın.
5. Pelet soğuk 500 µL hemen ile yıkayın taze hazırlanmış yıkama 850 x g ve 4 ° C 5 min için arabellek (bakınız Ek materyalleri tarifi için), santrifüj ve süpernatant atın.

3. Lizis ve Sonication

1. hazırla tam lizis arabellek (LB) (tarif için Ek materyalleri görmek) ve buz üzerinde sakin ol. 1 mL için 950 µL LB, proteaz inhibitörü konsantresi (25 x) 40 µL ve %100 10 µL kullanın PMSF.
2. Pelet tam LB 300 µL içinde pipetting tarafından resuspend ve 4'te 10 min için sallanan bir platformda yer ° C.
3. Solüsyon içeren temizleyicide aşağıdaki ayarları kullanarak örnekleri: Temp = 4 ° C, toplam süre = 7 dakika, “ üzerinde ” aralığı = 30 s, “ kapalı ” aralığı = 30 s, genlik = %25
   Not: Sonication koşulları her doku için optimize edilmiş olması gerekir ve kullanılan sonicator bağlı olarak değişir. 200 ile 600 arasında değişen yamultulmuş DNA sonucunda en düşük sonication ayarları kullanmak için önerilen boyut içinde bp. Yamultma büyük ölçüde doku türüne bağlı olarak, quanti değişirTy, sonication birim, crosslinking koşullar ve ekipman. Lütfen Tablo 1 ' deki sorun giderme kılavuzu'na başvurun.
4. Sonicated örneği 16.000 x g 4 ° C'de hücresel enkaz cips için 10 dk'spin.
5. Taze bir 1.5 mL tüp lysate (süpernatant) transfer.
   Not: başlangıç materyali iki çip deneyler için yeterli görüldüğü takdirde, o zaman 300 µL tam lb sonicated Kromatin eklenebilir (Yani, son hacim: 600 µL).
6. Ekleyin 30 µL % 10 octylphenol 300 her µL için ethoxylate sonicated lysate (son konsantrasyonu: % 1) ve karıştırın pipetting.
   Not: dikkat! Octylphenol ethoxylate akut toksik (oral, dermal, inhalasyon).

4. Antikor kuluçka

1. Aliquot 330 µL, sonicated iki 1.5 mL tüpler içine lysate: ChIP ve giriş denetiminin (başlangıç materyali %10) olarak 30 µL için 300 µL. Mağaza " 30 µL giriş denetimi örneğini ", -20 ° c
   Not: üç 1,5 mL tüpler (300 µL çip #1, ChIP #2 için 300 µL ve giriş denetimi (her çip başlangıç materyali %20) olarak 60 µL içine, 660 µL lysate sonicated sonra iki çip tepkiler aynı örnek gerçekleştirilmesi durumunda dağıtılabilir ).
2. Ekleyin antikor, 3-5 µg sonicated Kromatin aliquot ve karıştırmak için ters çevir'i 300 µL.
   Not: Bu çalışmada, her küçük parça tepki K4 metillenmiş Histon H3 tri için belirli bir antikor ile gerçekleştirildi (H3K4me3), Histon H3 di K4 metillenmiş (H3K4me2), Histon H3 tri K27 metillenmiş (H3K27me3) ve Histon H3 tri asetilasyon K27, (H3K27me3). Bu iletişim kuralı başarısı tamamen kullanılan antikor kalitesine bağlıdır. Antikor özel ve belirli bir protein immunoprecipitation, verimli olması gerekir. İmmunoprecipitate çapraz protein-DNA karmaşık kullanılabilir antikor miktarını belirlemek önemlidir. Ayrıca, antikor özgüllük Western blot tarafından doğru protein algıladığı emin olmak için kontrol edilebilir. Birden çok özel olmayan bantları algılar bir antikor küçük parça için tavsiye edilmez.
3. Koyun tüp 4 ° C'de antikor bağlamak için gecede (12-16 h) sallanan bir platformda Kromatin için.
   Not: Tablo 1 ' deki sorun giderme kılavuzu için lütfen bakın.

5. Manyetik boncuklar hazırlanması: 2 gün

1. Aliquot 50 - 100 µL Protein G/manyetik boncuk Bulamaç 1.5 mL microfuge içine her çip tepki için tüp buz üzerinde
2. Manyetik boncuklar üç kez soğuk blok çözüm ile yıkayın (tarif için Ek materyalleri görmek) (4 ° C). Ters çevirme veya flicking 500 µL soğuk blok çözüm ve karışımı ekleyin. Tüp manyetik tutucusuna koyun ve yan tarafında tüp yerleşmek boncuk için bekleyin. NET sıvı dökün ve tekrarlayın. Son yıkama sonra jel-yükleme bahşiş ile tüm sıvı kaldırmak.

6. Kromatin Immunoprecipitation

1. antikor bağlı Kromatin 300 µL yıkanmış boncuk ekleyin ve karışımı ters.
2. Antikor için boncuk bağlamak için Döndür dikey olarak 4 ° C en az 4 h için bir tüp rotator.

7. Yıkama, Elute ve Glossar ters

1. RIPA yıkama arabellek Chill (tarif için Ek materyalleri görmek) buz, su banyosu 65 ° C için ayarla ve 4 santrifüj precool ° C.
2. Dört kez 1 mL soğuk RIPA yıkama arabellek Kromatin bağlı boncuk yıkama ve buz üzerinde tutun. Bunu yapmak için ters çevirme veya flicking 1 mL soğuk RIPA yıkama arabellek ve karışımı ekleyin. Tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve boncuk tarafında tüp yerleşmek bekleyin. NET sıvı dökün ve yineleyin.
   Not: Yıkama ile RIPA yıkama arabellek sayısını optimize gerekebilir örnek türü, örnek bereket ve kullanılan antikor bağlı olarak. Yıkama artan sayıda arka plan azaltmak ama -ecek da azalma qPCR veya çip seq. göre aşağı akım analiz olumsuz etkileyebilir kurtarılan DNA'ın toplam tutarı
3. TE/50 mM NaCl 1 mL tüp ekleyin ve Kromatin bağlı boncuk TE/50 mm NaCl taze 1.5 mL microfuge tüp sıvı manyetik tutucu kullanarak yukarıda açıklandığı gibi kaldırmadan önce aktarın.
4. Boncuk 900 x g 4 ° C'de 3 dk de spin, tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve jel-yükleme bahşiş ile tüm kalan TE kaldırmak.
5. Ekle 210 µL elüsyon arabelleği (tarif için Ek materyalleri görmek) oda sıcaklığında ve flicking tarafından resuspend.
6. Elute sallayarak süre bir ısı blok içinde 65 ° C'de 15 dakika.
7. Boncuk 16.000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de spin ve tüp manyetik yuvasına yerleştirin.
8. Taze microfuge tüp boncuk yerleşmiş bir kez süpernatant (~ 200 µL) transfer.
9. Giriş denetimi örnekleri (30 µL)-20 ° c için oda sıcaklığında (Adım 4.1 dondurulmuş) çözülme elüsyon arabelleği (90 µL) 3 cilt ekleyip karıştırın kısaca tarafından vortexing.
10. 65 ° C'de Glossar tersine çevirmek için gecede (12-16 h) çip ve denetim örnekleri kuluçkaya.

8. Özet hücresel Protein ve RNA: gün 3

1. 8.1At Oda sıcaklığı, TE arabelleği (SDS sulandırmak için) tüp başına 1 birim ekleme ve karıştırmak için ters çevir: 120 µL denetim örneği ve TE 200 µL 200 µL çip örneği için TE 120 µL ekleyin.
2. Ekleyin karıştırmak için RNase A 0.2 mg/mL nihai toplama ve ters çevir'i: 240 µL denetim örneği ve 20 mg/ml RNase A 400 µL çip örneği için 4 µL 20 mg/ml RNase A 2.4 µL ekleyin.
3. Su banyosu için RNA sindirmek 2 h 37 ° C'de tüpler kuluçkaya.
4. K 0.2 mg/mL ve ters çevir'i son bir konsantrasyon karıştırmak için eklemek İndinavir: 240 µL denetim örneği ve 20 mg/mL İndinavir K çip örnek 400 µL 4 µL 20 mg/ml İndinavir K 2,4 µL ekleyin.
5. Protein sindirimi ve DNA arındırmak için bir su banyosu için 2 h 55 ° C'de Incubate.

9. ChIP-qPCR

Not: DNA çıkarma ve arıtma, Ek materyalleri açıklandığı gibi gerçekleştirmek.

Not: 200-500 bp DNA parçalarının ( şekil 3) elde edilen onaylamak için Ek materyalleri, açıklandığı gibi sonication verimliliği doğrulayın.

Not: çip gerçekten işe yaradı eğer belirlemek için kritik bir adımdır. Orada ilgi protein için genomik bağlayıcı siteleri biliniyorsa, astar kantitatif PCR (qPCR) bilinen siteler özellikle çip DNA'zenginleştirilmiş eğer belirlemek için bağlı kalacağınızı beklenen değil negatif kontrol bölgeleri ile karşılaştırıldığında dizayn edilebilir canditarihi proteinler. Örnek olarak, bu iş H3K4me3 için gerçekleştirilen fişleri ile elde edilen ChIP-qPCR sonuçlarını gösterir (etkin organizatörü Histon işareti) ve H3K27me3 (etkin olmayan organizatörü Histon işareti) HH14 civciv embriyo izole SNT bölümlerdeki ( şekil 4A ).

1. Aynı tüp her astar çifti (ileri ve geri) mix ve 20 µM, hisse senedi toplama her kullanarak hazırlamak dH ₂ O (Tablo 2).
   Not: her astar çifti verimliliğini ChIP-qPCR analiz daha önce değerlendirilmelidir.
2. Çip ve % 20 giriş denetimi adım 8.5 qPCR optimizasyonu için elde DNA kullanın.
   Not: DNA'sı genellikle giriş (ChIP reaksiyonlar kullanılan başlangıç materyali % 1 ') için 20 x qPCR analiz için seyreltilmiş.
3. İçin her 10 µL PCR, aşağıdaki bileşenler bir PCR tüp, mix: (DNA mastermix için dH2O, SYBR yeşil karışımı 2.5 µL ve DNA'ın 1 µL 2 µL çip ya da % 1 giriş) Ekle mastermix astar ile için; , dH2O, SYBR yeşil karışımı 2.5 µL ve ileriye ve geriye doğru astar Mix 0,125 µL 2.375 µL ekleyin.
4. Örnekleri 2 s ve kısaca santrifüj vasıl 900 x g 1 dk. için vortexing tarafından mix
5. Gerçek zamanlı PCR (astar ve bisiklet koşullarını burada kullanılan bir örnek Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla bulunabilir) gerçekleştirmek.
   Not: ChIP-qPCR veri analizi: ChIP sinyalleri giriş yüzdesi olarak hesaplanır. Kısaca, bir kez Ct değerleri elde edilir bir seyreltme faktörü 100 veya 6.644 döngüleri her qPCR tepki için (100 log2) giriş DNA reaksiyonlar için elde edilen Ct değerlerini uygulanır. Sonra faiz (Yani, astar çifti) belirli bir bölge için ChIP sinyalleri aşağıdaki gibi hesaplanır:
   ayarlanmış giriş Ct (giriş) - 6.644 =
   çip sinyal = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10. chIP-seq Kütüphane hazırlık; Son onarım: Gün 4

1. seyreltik 100'lere elüsyon arabelleği 60 µL içinde çip DNA'ın ng (malzemeler tablo bakınız).
2. Sonu Ekle 40 μL onarım mix ve yavaşça 10 kat pipet.
3. Incubate 30 ° c termal cycler üzerinde 30 dk için.
4. Girdap manyetik boncuklar ve 160 μL son onarım karışımı içeren tüp ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
5. Tüp manyetik tutucu içine yerleştirin ve yan tarafında..... tüp yerleşmek boncuk bekleyin
6. Net sıvı dökün.
7. Tüp üzerinde manyetik tutucu tutarken, taze hazırlanmış %80 200 μL eklemek alkol.
8. Incubate, oda sıcaklığında 30 s ve atma süpernatant için. Bir kere... tekrar
9. 15dk için tüp üzerinde manyetik tutucu oda sıcaklığında tutmak. Pelet kuru olduğunda, manyetik sahibinden tüpü çıkarması.
10. Pelet resuspension arabellek 20 μL içinde resuspend. Yavaşça 10 kez iyice karıştırmak için pipet.
11. Incubate oda sıcaklığında 2 dk için.
12. Tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve boncuk tarafında tüp yerleşmek bekleyin. 17,5 μL süpernatant ile yeni bir tüp transfer.

11. Çip seq Kütüphane hazırlık; Adenilat 3 ' biter

1. Yeni A-takip karışımı ekleyin 12,5 μL tüp ve yavaşça aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Tüp üzerinde termal bir cycler yerleştirin ve aşağıdaki programa göre kuluçkaya: 30 dk, 5 dk ve 4 ° C'de tutmak için 70 ° C için 37 ° C

12. Çip seq Kütüphane hazırlık; Bağdaştırıcıları ligate

1. resuspension ekleyin 2.5 μL tampon, 2.5 μL ligasyonu mix ve 2.5 μL uygun RNA bağdaştırıcısının dizin. İyice yavaşça aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından Mix.
2. Termal cycler 10 dk 30 ° Incubate.
3. Ekleyin 5 μL dur ligasyonu arabellek ve karışımı iyice tarafından 10 kez pipetting.
4. Girdap manyetik boncuklar ve 42,5 μL örnek için ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
5. Tüp manyetik tutucu içine yerleştirin ve yan tarafında tüp yerleşmek ve net sıvı dökmek boncuk bekleyin
6. Tüp üzerinde manyetik tutucu tutarken, taze hazırlanmış %80 200 μL eklemek alkol.
7. Incubate, oda sıcaklığında 30 s ve atma süpernatant için. Bir kez yineleyin.
8. Tüp manyetik tutucu üzerinde tutun ve izin örnek kuruması için 15 dk..
9. Manyetik sahibinden tüpü çıkarması ve Pelet resuspension arabellek 52,5 μL içinde resuspend. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. 2 min için oda sıcaklığında kuluçkaya, tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve boncuk tarafında tüp yerleşmek bekleyin. 50 μL açık süpernatant ile yeni bir tüp transfer.
10. Girdap manyetik boncuklar ve 50 μL örnek için ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
11. Tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve yan tarafında tüp yerleşmek ve net sıvı dökmek boncuk bekleyin.
12. Tüp üzerinde manyetik tutucu tutarken, taze hazırlanmış %80 200 μL eklemek alkol.
13. Incubate, oda sıcaklığında 30 s ve atma süpernatant için. Bir kez yineleyin.
14. Tüp manyetik tutucu üzerine alın ve 15 dk. için Kuru örnek hava izin
15. Manyetik sahibinden tüpü çıkarması ve Pelet resuspension arabellek 27,5 μL içinde resuspend. İyice 10 kez pipetting tarafından Mix.
16. Incubate 2 dk, oda sıcaklığında tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve boncuk tarafında tüp yerleşmek bekleyin. 25 μL açık süpernatant ile yeni bir tüp transfer.

13. Çip seq Kütüphane hazırlık; DNA parçalarının amplifikasyon

1. , 0.2 mL PCR şablonunun yer 12.5 µL tüp. PCR astar kokteyl 2.5 μL, Gelişmiş PCR karışımı Mix 10 μL iyice aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından ekleyin. Tüp üzerinde termal bir cycler ve Tablo 4 ' te açıklanan koşullar kullanın.
2. Girdap manyetik boncuklar ve 25 μL örnek için ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
3. Tüp yer manyetik tutucu, tüp tarafında yerleşmek ve net sıvı dökmek boncuk bekleyin.
4. Tüp üzerinde manyetik tutucu tutarken, taze hazırlanmış %80 200 μL eklemek alkol. 30 s ve atma süpernatant için oda sıcaklığında kuluçkaya. Bir kez yineleyin.
5. Tüp manyetik tutucu ve izin örnek hava kuru için 15 dk. tutun manyetik sahibinden tüpü çıkarması ve Pelet resuspension arabellek 32,5 μL içinde resuspend. İyice 10 kez pipetting tarafından Mix.
6. Kuluçkaya oda sıcaklığında 2 min için PCR tüp/levha. Oda sıcaklığında manyetik stand PCR tüp/tabak yerleştirin, tüp tarafında yerleşmek ve süpernatant ile 30 μL için yeni bir tüp aktarmak boncuk bekleyin.

14. Çip seq Kütüphane hazırlık; Kitaplık doğrulama

Not: doğrulama kütüphanesi bir DNA ve RNA kalite kontrol sistemi kullanarak gerçekleştirilir. Merdiveni hazırlanması: aliquot 1 µL genomik DNA merdivenin ilk içine tüp/iyi ve örnek arabelleği 3 µL ekleyin.

1. Örnek hazırlanması: 1 µL Kütüphane örneği (10-100 ng/µL) 3 µL örnek arabelleği bir tüp ile karıştırın. Spin aşağı ve sonra örnek tüp sonundaki pozisyon vortex Tarih 5 s. Spin için için en yüksek hızı.
2. Örnekleri kalite kontrol sistemini yüklemek.
Çalışma tamamlandıktan sonra
3. analiz sonuçları hiçbir astar dimer örnek ( şekil 5) mevcut; astar dimer bir band yaklaşık 135 karşılık emin olmak için en büyük değer, karşıtlığı ayarlayarak bp. Hatta zayıf bir grup varsa, bir ikinci temizlik için elüsyon arabelleği ekleyerek devam (Malzemeler tablo bakın) 50 µL birime ve karışık manyetik boncuklar 47,5 µL ekleyin. Örnek konsantrasyonu çok düşükse (< 2 nM), PCR (adım 13,1) çalıştırmak için devam, 15, örnek 12.5 µL hacmi ile yerine 18 döngüleri kullanma--dan adım 12.16 yaptı.
4. Ölçmek kitaplıkları tek tek piyasada Kitleri kullanarak qPCR.
   Not: Havuzları kütüphanelerin tek oku 30 M okuma/örneği'hedefleyen 1 x 50 nt iletişim kuralı ile bir sequencer kullanarak sıralı.

Bizim çip protokol performansını göstermek için biz ChIP-seq HH19 tavuk bebekleri havuza alınan SNT bölümleri kullanarak deneyler, HH22 üst çıkıntıların tavuk embriyo ve sahne-HH3 tavuk bebekleri bağlama profilleri araştırmak için gerçekleştirilen çeşitli Histon değişiklikler (Yani, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 ve H3K27me3). Bir kez çip DNA'lar elde edilmiştir, sonication verimliliği karşılık gelen giriş DNA'lar (şekil 3) özel Jel Elektroforez tarafından incelendi. O zaman, ChIP ve giriş DNA'lar ya bağlı veya incelenen Histon değişiklikler (şekil 4A) tarafından ilişkisiz bekleniyor loci, enrichments ölçmek için ChIP-qPCR analiz için kullanılmıştır. Şekil 4A, H3K27me3 ve H3K4me3 zenginleştirme gösterilen örnekte HH19 SNT bölümleri seviyelerinde SOX17 ve SOX2, sırasıyla etkin ve aktif SNT, iki gen organizatörü bölgelerinde ChIP-qPCR tarafından değerlendirildi. SOX17 organizatörü ters desen (şekil 4A) gösterdi iken beklendiği gibi SOX2 organizatörü şiddetle H3K4me3 ama H3K27me3, değil kutlandı. Birkaç loci değerlendirerek, çip kalitesini çok DNA malzeme akış aşağı ChIP-seq analiz için kaybetmeden tahmin etmek mümkündür. Fişleri kalitesini onayladıktan sonra ChIP-seq kitaplıkları hazırlanan ve sıralı. Temsilcisi loci her incelenen tavuk embriyonik dokular için gösterilir: (i) H3K27me3 ve H3K4me3 için HH19 SNT civciv embriyo PAX7 (şekil 4B); çevresinde içinde profilleri (II) profilleri H3K4me2 ve H3K27ac için HH22 tavuk bebekleri SNAI1 (şekil 4 c); etrafında üst çıkıntıların ve H3K27me3 için (III) profilinde HH3 aşamalı tavuk bebekleri TBX3/TBX5 odağı (şekil 4 d) çevresinde. Bu çip seq deneyler açıkça bizim çip Protokolü embriyonik dokuların geniş bir aralıktaki biyolojik malzeme sınırlı miktarda epigenomic profilleri oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: tavuk bebekleri izole düşük-bereket embriyonik örnekleri için ChIP Protokolü şematik bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: kısa bir genel bakış SNT mikrodiseksiyon protokolünün. Enine SNT segment bir HH19 tavuk embriyo Brakiyal düzeyinde kesilir. Tripsin tedavi sonrası mekanik forseps kullanarak olmayan sinir dokusu kaldırılır. Değil, notochord; SNT, spinal Nöral tüp; ve bu yüzden, somite. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: en iyi Sonication örneği. Bir tavuk SNT HH19 örnek 30 s ON ve "yüksek" genlik bir sonicator kullanarak, 45 s OFF darbeleri ile 11 devir için sonicated. Glossar geri alındı ve saf DNA üzerinde % 1.5 özel jel çözüldü. En iyi parçası boyutu 11 döngüleri, 200-500 bp. değişen sonra gözlenen Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: ChIP-qPCR veya çip seq. göre çip analiz örnekleri temsilcisi (A)H3K27me3 (solda) ve H3K4me3 (sağda) düzeyde belirtilen bölgeler HH19 civciv embriyo izole SNT bölümleri kullanarak gerçekleştirilen ChIP-qPCR analizi tarafından ölçülen. SOX2 organizatörü bölge içinde SNT etkindir ve böylece H3K4me3 ancak değil H3K27me3 tarafından işaretlenir; SOX17 organizatörü bölge içinde SNT etkin değil ve bu nedenle H3K27me3 ama H3K4me3 içinde zenginleştirilmiş; Chr6 negatif tavuk Kromozom 6 intergenic bir bölgede temsil eder ve bir negatif kontrol hizmet vermektedir. Hata çubukları standart sapma üç teknik çoğaltır temsil eder. (B) ChIP-seq (Eflatun, H3K27me3, H3K4me3 mavi ve kırmızı giriş) HH14 SNTs civciv embriyo profillerden PAX7 odağı gösterilir. (C) ChIP-seq (H3K4me2 turuncu, H3K27ac yeşil ve kırmızı giriş) HH22 civciv embriyo üst çıkıntıların profillerden SNAI1 odağı gösterilir. (D) ChIP-seq HH3 civciv embriyo (magenta H3K27me3) ve giriş kırmızı profillerden TBX3/TBX5 odağı gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: ChIP-seq kitaplığı otomatik RNA kalite kontrol sistemi kullanarak doğrulama örneği. Aynı çip seq kitaplıkları otomatik RNA kalite kontrol sistemi(a)önce ile analiz edildi ve (B) astar dimer Temizleme sonra. Astar dimer zayıf ~ 135 bp grupta (A) olarak görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 2: Astar dizileri ChIP-qPCR.

Tablo 3: PCR koşulları ChIP-qPCR için.

Tablo 4: PCR DNA parçalarının amplifikasyon ChIP-seq Kütüphane hazırlık sırasında için koşullar.

Epigenomic çip seq kullanarak Histon modifikasyonu profil oluşturma farklı hücresel bağlamlarda^4,5,18omurgalı genleri fonksiyonel ek açıklama geliştirmek için kullanılabilir. Bu epigenomic profilleri, diğer şeyler arasında artırıcı öğeleri, arttırıcılar (hazır veya hazırYani, aktif,) yasal durumunu tanımlamak ve farklı biyolojik büyük hücre kimlik düzenleyiciler tanımlamak için tanımlamak için kullanılabilir veya patolojik bağlamlarda (Örneğin, geniş H3K4me3 düzenleyici etki ve süper-arttırıcılar)^{6,7,9,10,11,19}. Ancak, genellikle milyonlarca hücre gerektirir, ChIP testin doğasında sınırlaması nedeniyle vivo içinde büyük miktarlarda profilleri vitro hücre hatlarında oluşturulan ve hücre olabilir türleri çoğu Histon değişikliği sıralı ⁴. son olarak, birkaç küçük parça-seq protokol böylece önemli ölçüde genişleyen aralığın hücre tiplerinin son derece düşük hücre sayıları ile uyumlu olan açıklanan ve hangi epigenomic profilleri ilke olarak, olabilir doku oluşturulan^{13 ,14,15,16}. Bu yeni küçük parça-seq iletişim kuralları her, en azından bazı durumlarda standart ekipman ve/veya reaktifler^14,15,16gerektiren belirli özel Kütüphane hazırlık yöntemleri üzerinde güveniyor.

Burada, vivo içinde farklı embriyonik doku¹⁰' dan elde edilen düşük orta hücre sayıları (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ hücreleri) olarak çalışan bir çip Protokolü açıklar. Bizim çip deneyleri duyarlılığını artırmak için birkaç adım normalde sıralı hücre ve malzeme değerli bir ilerici kaybına neden olabilir nükleer lizis gibi ChIP sırasında kullanılan elemiş. Böylece, crosslinking sonra örnekleri ile bir tek lizis tampon kabul edilir ve daha sonra örnek kaybı en aza indirmek için sonicated. Önemlisi, bizim çip Protokolü böylece seçili loci ilgi epigenomic analizini etkinleştirme qPCR analizi ile uyumludur. Ayrıca, bizim çip Protokolü böylece potansiyel olarak çoğu Laboratuvarları ile yeni nesil sıralama teknolojiye erişim yararlı olmak standart ChIP-seq kitaplık hazırlama yöntemleri ile kombine edilebilir.

ChIP ve ChIP-seq protokolleri bağlama profilleri Histon değişiklikler araştırmak için hem de diğer önemli transkripsiyon düzenleyiciler, transkripsiyon faktörleri ve ortak harekete geçirmek (Örneğin, gibi bağlayıcı siteleri ortaya çıkarmak için kullanılabilir P300 ve CBP)²⁰. Tipik olarak, fiş (ve ChIP-seq) için transkripsiyon faktörleri ve ortak harekete geçirmek, Histon gibi bol olmayan, cips daha önemli ölçüde daha başlangıç malzeme Histon işaretleri için gerektirir. Böylece, açıklanan protokolü çoğu transkripsiyon faktörleri için işe yaramayabilir veya eş aktivatörleri başlangıç sayısını hücreleri olmadıkça önemli ölçüde arttı (Örneğin, 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ hücreler) ve/veya çok özel ve verimli antikorlar mevcuttur. Yine de, daha da iyileştirme ve sürekli iyileştirilmesi kitaplık hazırlama yöntemleri ile biz ChIP-seq sınırlı hücresel malzemeden en düzenleyici proteinler için mümkün olacak tahmin.

ChIP ve ChIP-seq protokolümüze kapsamlı Histon modifikasyonları ve embriyonik dokular çeşitli için doğrulanmış rağmen biz yüksek kaliteli epigenomic profilleri oluşturmak için gerekli düşünün bazı kritik adımlar vurgulamak istiyorum. İlk olarak, embriyonik örnekleri taze Kromatin bütünlüğü tehlikeye değil koşullar altında izole gerek. Bu kadar yeterli malzeme birikmiş diseksiyonlarının soğuk koşulları ya da flash-donma havuza alınan örnekleri altında performans içerir. Başka bir kritik adımdır sonication, doğru bir şekilde yüksek kaliteli cips gerçekleştirmek için optimize edilmiş olması gerekir. En iyi sonication koşulları sık, doku türüne bağlı olarak, doku veya kullanılan sonicator miktarı değişir. Son fakat en az değil, başarılı bir çip sonuçta özel ve çip uyumlu antikorlar karşı ilgi proteinler kullanır.