Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Borne-translational modificações do histone estão directamente envolvidas nos diversos processos dependentes de cromatina, incluindo a transcrição, replicação e reparo de ADN a^1,2,3. Além disso, modificações do histone diferentes mostram positivas (por exemplo, H3K4me3 e H3K27ac) ou negativo (por exemplo, H3K9me3 e H3K27me3) correlações com a expressão de gene e pode ser amplamente definida como marca de histona ativando ou repressiva, respectivamente,^2,3. Por conseguinte, mapas de modificação do histone global, também conhecidos como epigenomic mapas, têm emergido como ferramentas poderosas e universais para anotar funcionalmente genomas vertebrados^4,5. Por exemplo, sequências reguladoras distais como potenciadores podem ser identificados baseiam na presença de assinaturas específicas da cromatina (por exemplo, potenciadores de ativo: H3K4me1 e H3K27ac), que distingui-las das regiões proximais promotor (por exemplo, ativos promotores: H3K4me3)^6,7,8. Por outro lado, os genes com funções reguladoras de identidade de células grandes são encontrados tipicamente com domínios de cromatina amplo marcados com H3K4me3 ou H3K27me3, dependendo do estado transcricionalmente ativo ou inativo dos genes subjacentes, respectivamente^{9 ,10}. Da mesma forma, a expressão de genes de identidade principal célula parece ser frequentemente controlado por múltiplo e espacialmente agrupado realçadores (ou seja, super potenciadores), que podem ser identificadas como grandes domínios H3K27ac-marcado¹¹.

Atualmente, mapas de modificação de histonas são gerados usando a tecnologia de ChIP-seq, que, em comparação com abordagens anteriores como ChIP-chip (ChIP acoplado ao microarrays) fornece maior resolução, menos artefatos, menos ruído, maior cobertura e menor custa¹². No entanto, a geração de mapas de epigenomic usando a tecnologia de ChIP-seq tem suas limitações inerentes, principalmente associadas com a capacidade de executar com êxito o ChIP nas amostras de interesse. Protocolos de ChIP tradicionais normalmente necessários milhões de células, que limite a aplicabilidade deste método de vitro em células, linhas ou células que pode ser facilmente isoladas na vivo (por exemplo, células do sangue). Nos últimos anos, um número de protocolos modificados de ChIP compatíveis com celulares de baixo foram descritos^13,14,15,16. No entanto, esses protocolos são projetados especificamente para ser acoplado a próxima geração sequenciamento (i.e., ChIP-seq), e eles geralmente usam ad-hoc biblioteca preparação métodos^{13,14, 15 , 16}.

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP que pode ser usado para investigar perfis de modificações do histone usando números de telemóvel baixas a intermédias (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ células) em qualquer loci selecionado (ou seja, ChIP-qPCR) ou globalmente (ou seja, ChIP-seq) (Figura 1). Quando acoplado à tecnologia ChIP-seq, nosso protocolo de ChIP pode ser usado em conjunto com os métodos de preparação de biblioteca padrão, tornando-se amplamente acessível para muitos laboratórios¹⁰. Este protocolo tem sido usado para investigar várias marcas de histona (por exemplo, H3K4me3, H3K27me3 e H3K27ac) em tecidos embrionários de frango diferente (por exemplo, na coluna tubo neural (SNT), proeminências frontonasal e epiblasto). No entanto, nós antecipamos que deve ser amplamente aplicável para outros organismos em que amostras biologicamente e/ou clinicamente relevantes podem ser obtidas apenas em pequenas quantidades.

de acordo com orientações de cuidados com animais alemão, nenhuma aprovação institucional Animal cuidados e uso Comité (IACUC) era necessária para realizar os experimentos de embrião de galinha. De acordo com as diretrizes locais, apenas experiências com embriões de galinha HH44 (18 dias) e mais velhos requerem aprovação IACUC. No entanto, os embriões utilizados neste estudo foram todos em estágios iniciais de desenvolvimento embrionário (i.e., HH19 (72 h)).

Nota: O propósito do presente protocolo é fornecer uma descrição detalhada do ensaio ChIP para efetivamente pode ser combinada com o sequenciamento de próxima geração (ou seja, ChIP-seq) para investigar as modificações do histone ou qPCR em baixo-abundância embrionárias amostras (que variam de 5 x 10 ⁴-5 x 10 ⁵ células para cada reação de ChIP) e tipos diferentes de tecido ( Figura 1). O protocolo deverá ser aplicável para investigar os perfis de ligação dos fatores de transcrição e co-ativadores (por exemplo, p300). No entanto, devido à baixa abundância destas proteínas reguladoras, maior número de células é susceptível de ser necessário (5 x 10 ⁵ - 5 x 10 ⁶ células para cada reação de ChIP).

1. preparação de ovos e Microdissection do SNT a galinha

Nota: O procedimento para microdissections tecnicamente difere de tecido para tecido e do modelo animal ao modelo animal. Esta seção descreve em detalhes o protocolo de dissecação usado para obter seções SNT braquiais do palco-HH19 embriões de galinha como exemplo.

1. Incubar os ovos de galinha leghorn branca fértil, obtidos de um criador local, na orientação horizontal em 37 ° C e 80% de umidade por 3 dias para chegar ao palco-HH19 embriões de galinha.
2. Determinar os estágios de acordo com o Hamburger e Hamilton frango embrionária desenvolvente preparo sistema ¹⁷.
3. Executar todos os microdissections sob condições frias; caso contrário, integridade da cromatina pode estar comprometida.
4. Isolar os embriões HH19.
   1. Para os embriões tornar acessível, extrair 3 mL de albumina utilizando uma seringa de 10 mL com agulha (0,90 x 40 mm) para abaixar a Drosophila.
   2. Fazer um pequeno orifício no ovo com uma tesoura bem e adicionar 1 mL de solução de Locke (veja os Materiais complementares para a receita) para facilitar a remoção das membranas extra embrionárias.
   3. Injetar solução a 10% indiano tinta preto/Locke usando uma seringa de 1 mL com agulha (0,55 x 25 mm ²) sob a Drosophila para facilitar a visualização dos embriões.
   4. Cortar a membrana extra embrionária que circunda o embrião usando médica cirúrgica bem tesoura e pinça.
   5. Usar uma colher perfurada para transferir o embrião para uma placa de Petri contendo 20 mL de solução de PBS de 1x de 4,5 cm.
5. Embora dissecar o âmnio e as restantes partes da membrana extra embrionária usando fina tesoura e pinça sob um estereomicroscópio.
6. Cortar o segmento SNT transversal ao nível braquial do embrião, estendendo-se caudalmente para a região torácica para isolar o SNT ( Figura 2).
7. Remover os tecidos que rodeiam lateralmente/ventralmente o SNT (por exemplo, a placa lateral mesoderme, ectoderme, notocorda e aorta) usando fórceps ( Figura 2).
8. Mergulhe cada segmento SNT frango dissecado em uma placa de Petri contendo 5 mL de tripsina quente (37 ° C) (tripsina/EDTA solução 1: 250) de 3,5 cm.
9. Parar o tratamento de tripsina quando afrouxamento dos tecidos não-neurais em torno do SNT é detectado sob um estereomicroscópio.
   Nota: O tempo de tripsinização deve ser rigidamente controlado para evitar o excesso de digestão e dispersão do tecido neural e manter a integridade estrutural do SNT.
10. Após o tratamento de tripsina, remover os restantes tecidos mesenquimais e ectodérmicos manualmente para preparar a limpo SNT.
11. Transferir a seção SNT para um tubo de 1,5 mL e congelam-no nitrogênio líquido. Uma vez suficiente SNT de seções é acumulada (piscina o SNT seções de embriões de galinha ~ 30 para uma reação de ChIP), loja a -80 ° C.
    Nota: Se suficiente tecido embrionário (ou seja, 5 x 10 ⁵-5 x 10 ⁶ células) pode ser dissecado de um único ou alguns embriões de galinha, em seguida, congelamento não é necessário e é possível directamente para as próximas etapas. Por favor, consulte o guia de solução de problemas na tabela 1.
    Nota: cuidado! Nitrogênio líquido tem uma temperatura extremamente baixa, usar proteção adequada.

2. Proteínas de reticulação de DNA: 1 dia

Nota: executar todas as etapas no gelo, salvo indicação em contrário.

1. Adicionar 500 µ l de DMEM com 10% FBS e 10 µ l de 1 M at-butirato diretamente ao tecido congelado ou, alternativamente, imediatamente para o tecido recém dissecado. Homogeneizar as células por re-suspender suavemente com uma pipeta de 1 mL.
   Nota: A adição de at-butirato é opcional mas recomendado se investigando acetilação da histona. Em vez de DMEM - 10% FBS, amostras podem ser resuspended em 1X PBS com 0,1% de BSA. A adição de FBS ou BSA é opcional, mas facilita as amostras nas etapas subsequentes de centrifugação de granulação.
2. Adicionar 13,5 µ l de formol 37% (1% final de formaldeído) e coloque-o em um rotador durante 15 minutos à temperatura ambiente.
   Nota: cuidado! O formaldeído é tóxico.
3. Adicione 25 µ l de glicina de 2,5 M para o tubo e coloque-o em um rotador durante 10 minutos à temperatura ambiente para saciar o formol.
4. Girar o tubo a 850 x g por 5 min a 4 ° C em uma centrífuga de mesa. Descartar o sobrenadante.
5. Lavar o sedimento de uma vez com 500 µ l de frio preparada na hora da lavagem (veja os Materiais complementares para a receita), centrífuga de buffer em 850 x g e 4 ° C por 5 min e descartar o sobrenadante.

3. Lise e Sonication

1. lise completa preparar amortecedor (LB) (consulte os Materiais complementares para a receita) e calma no gelo. Para 1 mL, usar 950 µ l de LB, 40 µ l de concentrado de inibidor de protease (x 25) e 10 µ l de 100% PMSF.
2. Resuspenda o pellet em 300 µ l de LB completa pipetando e coloque-o sobre uma plataforma oscilante para 10 min a 4 ° C.
3. Proceda à sonicação das amostras usando as seguintes configurações: Temp = 4 ° C, tempo Total = 7 minutos, “ na ” intervalo = 30 s, “ fora ” intervalo = 30 s, amplitude = 25%
   Nota: Condições Sonication precisam ser otimizado para cada tecido e irão variar dependendo do sonicador usado. Recomenda-se usar as configurações de sonication menores que resultam em DNA cortado que variam de 200 a 600 bp em tamanho. De corte varia muito dependendo do tipo de tecido, quantiTy, o volume de sonication, reticulação condições e equipamentos. Por favor, consulte o guia de solução de problemas na tabela 1.
4. Girar a amostra lisada a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C e os restos celulares de Pelotas.
5. Transferir o lisado (sobrenadante) para um novo tubo de 1,5 mL.
   Nota: Se a matéria-prima é considerada suficiente para dois experimentos de ChIP, 300 µ l de LB completa pode ser adicionado à cromatina lisada (ou seja, o volume final: 600 µ l).
6. Adicionar 30 µ l de 10% Octilfenol etoxilato para cada 300 µ l de lisados lisado (concentração final: 1%) e misturar pipetando.
   Nota: cuidado! Octilfenol etoxilato é tóxica aguda (oral, dérmica, inalação).

4. Incubação do anticorpo

1. alíquota a 330 µ l de lisados lisado em dois tubos de 1,5 mL: 300 µ l para ChIP e 30 µ l de como o controle de entrada (10% da matéria-prima). Loja do " 30 µ l da amostra controle de entrada " a -20 ° C.
   Nota: Se duas reações de ChIP são realizadas da mesma amostra, em seguida, a 660 µ l de lisados lisado podem ser distribuídas em três tubos de 1,5 mL (300 µ l para ChIP #1, 300 µ l para ChIP #2 e 60 µ l como controle de entrada (20% da matéria-prima de cada ChIP) ).
2. Adicionar 3 a 5 µ g de anticorpo para o 300 µ l de alíquota lisada cromatina e invertido para misturar.
   Nota: Neste estudo, cada reação do ChIP foi realizada com um anticorpo específico para tri histona H3 misturado no K4 (H3K4me3), di histona H3 misturado no K4 (H3K4me2), tri de histona H3 misturado no K27 (H3K27me3) e acetilação da histona H3 tri no K27 (H3K27me3). O sucesso do presente protocolo é totalmente dependente da qualidade do anticorpo usado. O anticorpo deve ser específico e eficiente para a imunoprecipitação de uma proteína específica. É importante determinar a quantidade de anticorpos que podem ser usado para immunoprecipitate o quitosana proteína-ADN complexo. Além disso, a especificidade do anticorpo pode ser verificada por Western blot para garantir que ele detecta a proteína correta. Um anticorpo que detecta várias bandas inespecíficas não é recomendado para ChIP.
3. Colocar o tubo em uma plataforma de balanço a 4 ° C durante a noite (12-16 h) para vincular o anticorpo para a cromatina.
   Nota: Por favor, consulte o guia de solução de problemas na tabela 1.

5. Preparação dos grânulos magnéticos: dia 2

1. alíquota de 50 - 100 µ l de chorume de grânulo proteína G/magnético para cada reação de ChIP em uma microcentrífuga de 1,5 mL tubo na Ice.
2. Lave os grânulos magnéticos três vezes com solução fria de bloco (Ver os Materiais complementares para a receita) (4 ° C). Adicione 500 µ l de solução de bloco frio e misture invertendo ou passar rapidamente. Colocar o tubo em um suporte magnético e esperar que as contas a acertar na lateral do tubo. Despeje o líquido claro e repetir. Após a última lavagem, retire todo o líquido com uma ponta de gel-carregamento.

6. Imunoprecipitação da cromatina da

1. Adicionar a 300 µ l de cromatina de anticorpos ligados aos talões lavados e inverter para misturar.
2. Girar verticalmente em rotacao tubo a 4 ° C, durante pelo menos 4 h para vincular o anticorpo aos talões.

7. Lavar, eluir e inverter as ligações cruzadas

1. Chill RIPA o tampão de lavagem (veja os Materiais complementares para a receita) no gelo, defina o banho de água a 65 ° C e precool a centrifugação a 4 ° C.
2. Lave os grânulos de cromatina-limite quatro vezes em 1 mL de tampão de lavagem frio RIPA e manter no gelo. Para fazer isso, adicione 1 mL de frio RIPA de tampão de lavagem e misture invertendo ou passar rapidamente. Colocar o tubo no suporte magnético e esperar que as contas a acertar na lateral do tubo. Despeje o líquido claro e repetir.
   Nota: O número de lavagens com tampão de lavagem RIPA pode precisar ser otimizada dependendo do tipo de amostra, abundância de amostra e anticorpo que está sendo usado. Aumento do número de lavagens irá diminuir o plano de fundo, mas também irá diminuir a quantidade total de DNA recuperado, que pode comprometer a jusante análise por qPCR ou ChIP-Seq.
3. Adicionar 1 mL de TE/50mm NaCl ao tubo e transferir os grânulos de cromatina-limite em TE/50mm NaCl para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco antes de retirar o líquido, usando o suporte magnético, como descrito acima.
4. Girar os grânulos a 900 x g, durante 3 min a 4 ° C, coloque o tubo de volta no suporte magnético e remover TE todos os restante com uma ponta de gel-carregamento.
5. Adicionar 210 µ l de tampão de eluição (consulte os Materiais complementares para a receita) em temperatura ambiente e ressuspender por agredir.
6. Elute durante 15 minutos a 65 ° C, em um bloco de calor agitando.
7. Girar os grânulos a 16.000 x g por 1 min à temperatura ambiente e coloque o tubo no suporte magnético.
8. Transferir o sobrenadante (~ 200 µ l) para um tubo de microcentrífuga fresco, uma vez que os grânulos se instalaram.
9. Descongelar as amostras de controle de entrada (30 µ l) de-20 ° C a temperatura ambiente (congelado na etapa 4.1), adicionar 3 volumes de tampão de eluição (90 µ l) e misture brevemente vortexing.
10. Incubar os chip e controle de amostras a 65 ° C durante a noite (12-16 h) para inverter as ligações cruzadas.

8. Digerir proteínas celulares e RNA: dia 3

1. 8.1At temperatura, adicionar 1 volume de tampão TE pelo tubo (para diluir o SDS) e inverter para misturar: Adicionar 120 µ l de TE a 120 µ l de amostra de controle e 200 µ l de TE a 200 µ l da amostra ChIP.
2. Adicionar RNase A uma concentração final de 0,2 mg/mL e invertido para misturar: adicionar 2.4 µ l de 20 mg/mL RNase A 240 µ l de amostra de controle e 4 µ l de RNase A 20 mg/mL a 400 µ l da amostra ChIP.
3. , Incubar os tubos a 37 ° C em banho-maria por 2 h digerir o RNA.
4. Adicionar Proteinase K para uma concentração final de 0,2 mg/mL e invertido para misturar: adicionar 2.4 µ l de 20 mg/mL de Proteinase K 240 µ l de amostra de controle e 4 µ l de Proteinase K de 20 mg/mL a 400 µ l da amostra ChIP.
5. Incubar a 55 ° C em banho-maria por 2 h para digerir a proteína e o DNA de purificar.

9. ChIP-qPCR

Nota: realizar a extração de DNA e purificação, conforme descrito nos Materiais complementares.

Nota: verificar eficiência sonication, conforme descrito nos Materiais suplementares, para confirmar que os fragmentos de DNA de 200-500 bp são obtidos ( Figura 3).

Nota: um passo crítico é determinar se o ChIP realmente funcionou. Se lá são conhecidos locais de genômica ligando da proteína de interesse, as primeiras demão podem ser projetadas para PCR quantitativo (qPCR) para determinar se os sites conhecidos são especificamente enriquecidos no ChIP de DNA, em comparação com as regiões de controle negativo não deverá ser ligado por a candiproteínas de data. Como exemplo, este trabalho mostra os resultados de ChIP-qPCR obtidos com fichas realizadas por H3K4me3 (marca de histona promotor ativo) e H3K27me3 (marca de histona promotor inativo) no SNT seções isoladas de embriões de pintainho HH14 ( Figura 4A ).

1. Misturar cada par de primer (frente e verso) no mesmo tubo e preparar uma concentração das ações em 20 µM cada usando dH ₂ O (tabela 2).
   Nota: a eficiência de cada par de primer deve ser avaliada antes da análise de ChIP-qPCR.
2. Usar o controle de entrada DNA obtido na etapa de 8,5 para otimização de qPCR ChIP e 20%.
   Nota: A entrada de DNA é tipicamente diluído x 20 (a 1% da matéria-prima utilizada nas reações ChIP) para análise de qPCR.
3. Para cada 10 µ l de PCR, misturar os componentes a seguir em um tubo PCR: para DNA mastermix, adicionar 2 µ l de dH2O 2,5 µ l de mistura SYBR verde e 1 µ l de DNA (a partir de entrada de 1% ou ChIP); para mastermix com primers , adicione 2.375 µ l de 0,125 µ l do mix de cartilha frente e verso, 2,5 µ l de mistura SYBR green e dH2O.
4. Misturar as amostras num Vortex durante 2 s e brevemente centrifugar a 900 x g por 1 min.
5. Realizar a PCR em tempo real (um exemplo de primers e ciclismo condições usadas aqui pode ser encontrado na tabela 2 e tabela 3, respectivamente).
   Nota: Análise de dados de ChIP-qPCR: sinais de ChIP são calculados como a porcentagem da entrada. Brevemente, uma vez valores de Ct são obtidos para cada reação qPCR, um factor de diluição de 100 ou 6.644 ciclos (log2 de 100) é aplicado para os valores de Ct obtidos para as reações de DNA a entrada. Então, para uma determinada região de interesse (ou seja, par de primer), os sinais de ChIP são calculados da seguinte forma:
   ajustado entrada = Ct (entrada) - 6.644
   sinal de ChIP = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10. chIP-seq biblioteca preparação; Reparo final: Dia 4

1. diluir até 100 ng de DNA-ChIP em 60 µ l de tampão de eluição (ver tabela de materiais).
2. Adicionar 40 μL de fim reparar mistura e pipetar suavemente 10 vezes.
3. Incubar a 30 ° C por 30 min em um termociclador.
Grânulos
4. vórtice magnético e adicionar 160 µ l para o tubo contendo a mistura de reparação final. Misture bem, pipetando 10 vezes. Incubar 15 minutos à temperatura ambiente.
5. Colocar o tubo no suporte magnético e esperar que as contas a acertar na lateral do tubo.
6. Decantar o líquido desobstruído.
7. , Mantendo o tubo no suporte magnético, adicionar 200 μL de acabadas 80% EtOH.
8. Incubar à temperatura ambiente por 30 s e descartar o sobrenadante. Repetir uma vez...
9. Manter o tubo durante 15 minutos sobre o suporte magnético à temperatura ambiente. Uma vez que o sedimento é seco, retire o tubo do suporte magnético.
10. Resuspenda o pellet em 20 μL de tampão de ressuspensão. Delicadamente, pipete 10 vezes para homogeneizar.
11. Incubar por 2 min à temperatura ambiente.
12. Colocar o tubo no suporte magnético e esperar que as contas a acertar na lateral do tubo. Transfira a 17,5 μL do sobrenadante para um tubo novo.

11. ChIP-seq biblioteca preparação; 3 adenilato ' termina

1. Adicionar 12,5 μL de mistura de rejeito-A para o novo tubo e misturar cuidadosamente pipetando delicadamente acima e para baixo 10 vezes. Colocar o tubo em um termociclador e incubá-los de acordo com o seguinte programa: 37 ° C por 30 min, 70 ° C durante 5 min e espera a 4 ° C

12. ChIP-seq biblioteca preparação; Ligate adaptadores

1. Adicionar 2,5 μL de ressuspensão buffer, 2,5 μL de mistura de ligadura e 2,5 μL de índice apropriado para a adaptador de RNA. Misturar cuidadosamente pipetando delicadamente acima e para baixo 10 vezes.
2. Incubar em um termociclador durante 10 minutos a 30 °.
3. Adicionar 5 μL de buffer de ligadura de paragem e misture completamente pipetando vezes 10.
Grânulos
4. vórtice magnético e adicionar 42,5 μL de amostra. Misture bem, pipetando 10 vezes. Incubar 15 minutos à temperatura ambiente.
5. Colocar o tubo no suporte magnético e esperar que os grânulos de resolver no lado do tubo e decantar o líquido claro
6. , Mantendo o tubo no suporte magnético, adicionar 200 μL de acabadas 80% EtOH.
7. Incubar à temperatura ambiente por 30 s e descartar o sobrenadante. Repetir uma vez.
8. Manter o tubo no suporte magnético e, deixe a amostra secar ao ar durante 15 min..
9. Retire o tubo do suporte magnético e resuspenda o pellet em 52,5 μL de tampão de ressuspensão. Misture bem, pipetando 10 vezes. Incubar a temperatura ambiente por 2 min, colocar o tubo no suporte magnético e esperar que as contas a acertar na lateral do tubo. Transferir 50 μL do sobrenadante claro para um tubo novo.
Grânulos
10. vórtice magnético e adicionar 50 μL de amostra. Misture bem, pipetando 10 vezes. Incubar 15 minutos à temperatura ambiente.
11. Colocar o tubo no suporte magnético e esperar que os grânulos para se estabelecer no lado do tubo e decantar o líquido desobstruído.
12. , Mantendo o tubo no suporte magnético, adicionar 200 μL de acabadas 80% EtOH.
13. Incubar à temperatura ambiente por 30 s e descartar o sobrenadante. Repetir uma vez.
14. Mantenha o tubo no suporte magnético e deixe o ar de amostra seca durante 15 min.
15. Retire o tubo do suporte magnético e resuspenda o pellet em 27,5 μL de tampão de ressuspensão. Misturar cuidadosamente pipetando 10 vezes.
16. Incubar à temperatura ambiente por 2 min, colocar o tubo no suporte magnético e esperar que as contas a acertar na lateral do tubo. Transferir 25 μL do sobrenadante claro para um tubo novo.

13. ChIP-seq biblioteca preparação; Amplificação de fragmentos de DNA

1. lugar 12,5 µ l do modelo em um 0,2 mL do PCR. Adicione 2,5 μL de primer PCR cocktail, 10 μL de reforçada PCR mix. Misture completamente pipetando acima e para baixo 10 vezes. Colocar o tubo em um termociclador e usar as condições descritas na tabela 4.
Grânulos
2. vórtice magnético e adicionar 25 μL de amostra. Misture bem, pipetando 10 vezes. Incubar 15 minutos à temperatura ambiente.
3. Colocar o tubo no suporte magnético, esperar que os grânulos para se estabelecer no lado do tubo e decantar o líquido desobstruído.
4. , Mantendo o tubo no suporte magnético, adicionar 200 μL de acabadas 80% EtOH. Incube a temperatura ambiente por 30 s e descartar o sobrenadante. Repetir uma vez.
5. Manter o tubo no suporte magnético e, deixe o ar de amostra seca durante 15 min. Retire o tubo do suporte magnético e resuspenda o pellet em 32,5 μL de tampão de ressuspensão. Misturar cuidadosamente pipetando 10 vezes.
Incube-
6. a PCR/placa de tubos por 2 min à temperatura ambiente. Coloque a tubo PCR/placa depor magnético à temperatura ambiente, esperar que os grânulos de resolver no lado do tubo e transferir 30 μL do sobrenadante para um tubo novo.

14. ChIP-seq biblioteca preparação; Validação da biblioteca

Nota: A validação da biblioteca é executada usando um sistema de controle de qualidade de DNA e RNA. Preparação da escada: alíquota 1 µ l de escada de DNA genômico do primeiro tubo/bem e adicione 3 µ l de tampão de amostra.

1. Preparação da amostra: misturar 1 µ l da amostra biblioteca (10-100 ng / µ l) com 3 µ l de tampão de amostra em um tubo. Spin-down e, em seguida, vórtice na velocidade máxima por 5 s. Spin para baixo para posicionar a amostra no fundo do tubo.
2. Carregar as amostras para o sistema de controle de qualidade.
3. , Uma vez que a execução é concluída, analisar os resultados, definindo o contraste, o valor máximo para certificar-se de que nenhum dímeros de primeira demão são presentes na amostra ( Figura 5); dímero da primeira demão deve corresponder a uma faixa de cerca de 135 bp. Se houver mesmo uma banda fraca, proceder a uma segunda limpeza pela adição de tampão de eluição (consulte a Tabela de materiais) até um volume de 50 µ l e adicionar 47,5 µ l dos grânulos magnéticos mistos. Se a concentração da amostra é muito baixa (< 2 nM), prossiga para executar o PCR (passo 13.1), usar 18 ciclos em vez de 15, com o volume de 12,5 µ l da amostra à esquerda da etapa 12.16.
4. Quantificar as bibliotecas individualmente por qPCR usando kits comercialmente disponíveis.
   Nota: Piscinas de bibliotecas podem ser sequenciadas usando um sequenciador com uma single-leitura do protocolo de nt 1 x 50 visando leituras/amostra de 30 M.

Para ilustrar o desempenho do nosso protocolo de ChIP, realizamos experimentos usando seções SNT em pool de embriões de galinha HH19, proeminências maxilares de HH22 frango embriões e embriões de galinha HH3-palco para investigar os perfis de ligação do ChIP-seq diversas modificações do histone (i.e., H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 e H3K27me3). Uma vez que o ChIP DNAs foram obtidos, a eficiência de sonication foi avaliada pela electroforese do gel do agarose dos DNAs de entrada correspondentes (Figura 3). Então, o ChIP e DNAs entradas foram utilizados para análise de ChIP-qPCR para medir os avanços em loci esperado para ser acoplado ou não acoplado pelas modificações do histone investigadas (Figura 4A). No exemplo mostrado na Figura 4A, H3K27me3 e H3K4me3 enriquecimento níveis nas seções HH19 SNT foram avaliados pelo ChIP-qPCR em torno das regiões de promotor de SOX17 e SOX2, dois genes que são inativos e ativos no SNT, respectivamente. Como esperado, o promotor SOX2 fortemente foi marcado por H3K4me3, mas não por H3K27me3, enquanto o promotor SOX17 mostrou o padrão oposto (Figura 4A). Avaliando alguns loci, é possível estimar a qualidade do ChIP sem perder muito material de DNA para análise a jusante do ChIP-seq. Uma vez que a qualidade dos ChIPs foi confirmada, ChIP-seq bibliotecas foram elaboradas e sequenciadas. Loci representativos é mostrados para cada um dos tecidos embrionários frango investigadas: (i) perfis para H3K27me3 e H3K4me3 em embriões de pintainho a SNT de HH19 em torno de PAX7 (Figura 4B); (ii) perfis para H3K4me2 e H3K27ac nas proeminências maxilares de embriões de galinha de HH22 em torno de SNAI1 (Figura 4); e (iii) o perfil para H3K27me3 em embriões de galinha HH3-estágio em torno o locus TBX3/TBX5 (Figura 4). Estas experiências de ChIP-seq ilustram claramente que nosso protocolo de ChIP pode ser usado para gerar perfis de epigenomic de quantidades limitadas de material biológico em uma ampla gama de tecidos embrionários.

Figura 1: visão geral esquemática do protocolo de ChIP para baixo-abundância embrionárias amostras isoladas de embriões de galinha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: breve visão geral do protocolo Microdissection SNT. O segmento SNT transversal é cortado ao nível de um embrião de galinha HH19 braquial. Após o tratamento de tripsina, o tecido não-neurais é removido mecanicamente usando fórceps. Não, a notocorda; SNT, espinhal tubo neural; e então, somite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: exemplo de ideal Sonication. Uma amostra de frango HH19 SNT era lisada por 11 ciclos, com 30 s ON e 45 pulsos OFF de s em "alta" amplitude usando um sonicador. As ligações cruzadas foram invertidas e o DNA purificado foi resolvido em um gel de agarose 1,5%. O tamanho do fragmento ideal é observado após 11 ciclos, que variam de 200-500 BP clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: representante exemplos de análise de ChIP ChIP-qPCR ou ChIP-Seq. (A) H3K27me3 (esquerda) e H3K4me3 (à direita) níveis nas regiões indicadas foram medidos por ChIP-qPCR análise realizada usando SNT seções isoladas de embriões de pintainho HH19. Região promotora SOX2 é ativa no SNT e, portanto, é marcada por H3K4me3, mas não por H3K27me3; região promotora SOX17 é inativa no SNT e, por conseguinte, é enriquecida no H3K27me3 mas não em H3K4me3; Chr6 Neg representa uma região intergênica no cromossomo de frango 6 e serve como um controle negativo. Barras de erro representam o desvio padrão de três repetições de técnicas. (B) ChIP-seq (H3K27me3 em magenta, H3K4me3 em azul e a entrada em vermelho) perfis dos embriões de pintainho SNTs de HH14 são mostrados ao redor o locus PAX7. (C) ChIP-seq (H3K4me2 em laranja, H3K27ac em verde e a entrada em vermelho) perfis das proeminências maxilares de embriões de pintainho HH22 são mostrados ao redor o locus SNAI1. (D) ChIP-seq (H3K27me3 em magenta) e a entrada em vermelho perfis de embriões de pintainho HH3 são mostrados ao redor o locus TBX3/TBX5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: exemplo de ChIP-seq biblioteca de validação usando o sistema de controle de qualidade de RNA automatizada. As mesmo ChIP-seq bibliotecas foram analisadas com o sistema automatizado de controle de qualidade de RNA antes (A) e depois (B) limpeza de dímero da primeira demão. Dímeros de primeira demão podem ser vistos como um fraco banda bp ~ 135 (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 2: Sequências de Primer para ChIP-qPCR.

Tabela 3: Condições PCR para ChIP-qPCR.

Tabela 4: Condições PCR para a amplificação de fragmentos de DNA durante a preparação da biblioteca de ChIP-seq.

Epigenomic caracterização das modificações do histone usando ChIP-seq pode ser usado para melhorar a anotação funcional de genomas de vertebrados em diferentes contextos celular^4,5,18. Estes perfis de epigenomic podem ser usados, entre outras coisas, para identificar elementos potenciador, para definir o estado regulador de realçadores (i.e., ativo, preparado, ou preparada) e definir reguladores de célula grande identidade em biológicas diferentes ou patológico de contextos (por exemplo, domínios de promotor H3K4me3 amplos e superpotenciadores)^{6,7,9,10,11,19}. No entanto, devido à limitação inerente do ensaio do ChIP, o que normalmente requer milhões de células, modificação de histona a maioria dos perfis foram gerados em linhas de células em vitro e célula tipos que podem ser classificados em vivo em grandes quantidades ⁴. mais recentemente, foram descritos vários protocolos de ChIP-seq que são compatíveis com celulares extremamente baixa, expandindo assim drasticamente a variedade de tipos de células e tecidos no qual epigenomic perfis podem, em princípio, ser gerado^{13 ,14,15,16}. Estes protocolos de ChIP-seq de novo cada dependem de métodos de preparação biblioteca específica ad hoc que, pelo menos em alguns casos, exigem equipamentos padronizados e/ou reagentes^14,15,16.

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP que funciona com baixo número de células intermediárias (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ células) obtido na vivo de diferentes tecidos embrionários¹⁰. Para aumentar a sensibilidade dos nossos ensaios de ChIP, eliminamos várias etapas normalmente usadas durante o ChIP, como célula sequencial e lise nuclear, que pode resultar em uma perda progressiva de material valioso. Assim, após a reticulação, amostras são tratadas com um tampão de Lise único e são posteriormente lisadas para minimizar a perda de amostra. Importante, nosso protocolo de ChIP é compatível com análise de qPCR, possibilitando assim a análise de epigenomic dos selecionados loci de interesse. Além disso, nosso protocolo de ChIP pode ser combinado com ChIP-seq biblioteca preparação métodos padrão, sendo assim potencialmente útil para a maioria dos laboratórios com acesso à tecnologia de sequenciamento de próxima geração.

ChIP e ChIP-seq protocolos podem ser usados não apenas para investigar os perfis de ligação de modificações do histone, mas também para descobrir os locais de ligação dos outros reguladores transcricionais importantes, tais como fatores de transcrição e co-ativadores (por exemplo, P300 e CBP)²⁰. Normalmente, ChIPs (e ChIP-seq) por fatores de transcrição e co-ativadores, que não são tão abundantes como as histonas, requerem consideravelmente mais matéria-prima do que ChIPs para marcas de histona. Assim, o protocolo descrito pode não necessariamente funcionar para a maioria dos fatores de transcrição ou co-ativadores, a menos que o número de partida células é consideravelmente aumentada (por exemplo, 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ células) e/ou altamente específicas e anticorpos eficientes estão disponíveis. No entanto, com mais de otimização e os métodos de preparação de biblioteca constantemente melhorando, prevemos que ChIP-seq de material celular limitado se torne viável para a maioria das proteínas reguladoras.

Embora nossos ChIP e ChIP-seq protocolos validados extensivamente para uma variedade de modificações do histone e tecidos embrionários, gostaríamos de destacar algumas etapas críticas que consideramos essenciais para a geração de perfis de alta qualidade epigenomic. Primeiro, as amostras embrionárias precisam ser recentemente isolados sob condições que não comprometam a integridade da cromatina. Estes incluem realizar dissecações sob condições de frio ou flash-congelamento em pool amostras até suficiente material é acumulado. Outro passo crítico é sonication, que precisa ser otimizado com precisão para executar fichas de alta qualidade. Condições ideais sonication frequentemente variam, dependendo do tipo de tecido, a quantidade de tecido, ou o sonicador sendo usado. Último mas não menos importante, um ChIP de sucesso depende em última análise, a disponibilidade de específicos e ChIP compatível com anticorpos contra as proteínas de interesse.