Summary

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Published: June 19, 2017
doi:

Summary

Ici, nous proposons un protocole pour la différenciation chondrogénique des cellules souches pluripotentes induites par les cellules mononucléaires du sang du cordon de l'omble.

Abstract

Le cartilage articulaire humain n'a pas la capacité de se réparer. La dégénérescence du cartilage est donc traitée non par traitement curatif mais par des traitements conservateurs. Actuellement, des efforts sont déployés pour régénérer le cartilage endommagé avec des chondrocytes expansés ex vivo ou des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Cependant, la viabilité et l'instabilité restreintes de ces cellules limitent leur application dans la reconstruction du cartilage. Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) ont reçu l'attention scientifique comme nouvelle alternative pour les applications regénératives. Avec une capacité d'auto-renouvellement illimitée et multipotence, les hiPSC ont été mis en évidence comme une nouvelle source de cellules de remplacement pour la réparation du cartilage. Cependant, l'obtention d'une quantité élevée de granulés chondrogéniques de haute qualité est un défi majeur pour leur application clinique. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules de descendance dérivées du corps embryoïde (EB) pour la différenciation chondrogénique. Une chondrogénèse réussie a été confirmée par PCR etD coloration avec bleu alcian, bleu de toluidine et anticorps contre les collagènes types I et II (COL1A1 et COL2A1, respectivement). Nous fournissons une méthode détaillée pour la différenciation des iPSC à base de cellules mononucléaires du sang du cordon de cordon (CBMC-hiPSC) en pastilles chondrogéniques.

Introduction

L'utilisation de hiPSCs représente une nouvelle stratégie pour le dépistage de drogue et les études mécanistes de diverses maladies. Du point de vue de la régénération, les hiPSC sont également une source potentielle de remplacement des tissus endommagés qui ont une capacité de guérison limitée, comme le cartilage articulaire 1 , 2 .

La régénération du cartilage articulaire natif a été un défi depuis plusieurs décennies. Le cartilage articulaire est un tissu doux et blanc qui recouvre la fin des os, les protégeant des frottements. Cependant, il a une capacité de régénération limitée lorsqu'il est endommagé, ce qui rend l'auto-réparation presque impossible. Par conséquent, la recherche axée sur la régénération du cartilage est en cours depuis plusieurs décennies.

Auparavant, la différenciation in vitro dans la lignée chondrogénique était habituellement réalisée avec des BMSC ou des chondrocytes indigènes isolés de l'articulation du genou 3 . Due tO leur potentiel de chondrogenic, BMSC et chondrocytes indigènes ont de nombreux mérites soutenant leur utilisation dans la chondrogénèse. Cependant, en raison de leur expansion limitée et de leur phénotype instable, ces cellules sont confrontées à plusieurs limitations dans la reconstruction des défauts du cartilage articulaire. Dans des conditions de culture in vitro , ces cellules ont tendance à perdre leurs propres caractéristiques après 3 à 4 passages, ce qui finit par affecter leurs capacités de différenciation 4 . En outre, dans le cas des chondrocytes indigènes, des dommages supplémentaires à l'articulation du genou sont inévitables lors de l'obtention de ces cellules.

Contrairement aux BMSC ou aux chondrocytes indigènes, les hiPSC peuvent se développer indéfiniment in vitro . Avec les conditions de culture appropriées, les hiPSC ont un grand potentiel en tant que source de remplacement pour la différenciation chondrogénique. Cependant, il est difficile de modifier les caractéristiques intrinsèques des hiPSC 5 . En outre, il faut plusieurs essais in vitro compliqués.Ps pour diriger le sort des hiPSC vers un type de cellule spécifique. Malgré ces complications, l'utilisation de hiPSC est toujours recommandée en raison de leur capacité d'auto-renouvellement élevé et de leur capacité à se différencier en cellules ciblées, y compris les chondrocytes 6 .

La différenciation chondrogénique est généralement effectuée avec des systèmes de culture tridimensionnels, tels que la culture de pastilles ou la culture de micromasses, en utilisant des cellules progénitrices de type MSC. Si vous utilisez le système HiPSC, le protocole pour générer des cellules progénitrices MSC diffère des protocoles existants. Certains groupes utilisent une culture monocouche de hiPSC pour convertir directement le phénotype en cellules MSC 7 . Cependant, la plupart des études utilisent les EB pour générer des cellules secondaires qui ressemblent aux MSC 8 , 9 , 10 , 11 .

Différents types de facteurs de croissance sont utilisés pour induire ChondrogeNesis. Habituellement, les protéines de famille BMP et TGFβ sont utilisées, seules ou en combinaison. La différenciation a également été induite avec d'autres facteurs, tels que GDF5, FGF2 et IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . On a montré que le TGFß1 stimule la chondrogénèse de manière dose-dépendante dans les MSC 16 . Par rapport à l'autre isotype, le TGFβ3, le TGFß1 induit une chondrogénèse en augmentant la condensation de la cellule mésenchymateuse pré-cartilagineuse. Le TGFβ3 induit la chondrogénèse en augmentant significativement la prolifération des cellules mésenchymateuses 17 . Cependant, le TGFβ3 est utilisé plus fréquemment par les chercheurs que TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 améliore l'expression de gènes liés aux composants de la matrice chondrogénique chez l'hommeChondrocytes articulaires dans des conditions in vitro 20 . BMP2 augmente l'expression de gènes critiques pour la formation de cartilage dans les MSC en combinaison avec des protéines TGFβ 21 . Il a également été démontré que BMP2 améliore de manière synergique l'effet du TGFβ3 par les voies Smad et MAPK 22 .

Dans cette étude, les CBMC-hiPSC ont été agrégés en EB en utilisant du milieu EB dans une boîte de Petri à faible fixation. Les cellules de dépassement ont été induites en fixant les EB à un plat revêtu de gélatine. La différenciation chondrogénique à l'aide de cellules secondaires a été réalisée par culture de pastilles. Le traitement à la fois avec le BMP2 et le TGFß3 a condensé avec succès les cellules et a induit une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) pour la formation de granules chondrogéniques. Cette étude suggère un protocole de différenciation chondrogénique simple mais efficace utilisant CBMC-hiPSCs.

Protocol

Ce protocole a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861). Les CBMC utilisés pour la reprogrammation ont été obtenus directement de la banque de sang de cordon de l'hôpital St. Mary's de Seoul. 1. Différenciation chondrogénique des iPSC Production CBMC-iPSC Générer des CBMC-hiPSC en utilisant le protocole montré dans nos travaux antérieurs 23…

Representative Results

Dans cette étude, nous avons généré des granulés chondrogéniques provenant de CBMC-hiPSC en induisant des cellules secondaires des EB. La différenciation chondrogénique a été induite par CBMC-hiPSC avec une forte pluripotence confirmée 11 . Un schéma simple de notre protocole est illustré à la figure 1A . Avant la différenciation, les colonies iPSC ont été développées ( figure 1B ). Les…

Discussion

Ce protocole a généré avec succès des hiPSC à partir de CBMC. Nous avons reprogrammé les CBMC aux hiPSC en utilisant un vecteur viral Sendai contenant des facteurs Yamanaka 24 . Trois cas ont été utilisés en différenciation, et toutes les expériences ont généré avec succès des granulés chondrogéniques avec ce protocole. De nombreuses études ont rapporté des protocoles pour la différenciation des hiPSC en chondrocytes 25 , 26…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention du projet de R & D en matière de technologie de la santé de Corée, Ministère de la santé, du bien-être et de la famille, République de Corée (HI16C2177).

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP 93100
6-well Plate TPP 92006
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
Name Company Catalog Number Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES Life Technologies 11330-057 E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080-094 E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite Sigma Aldrich S5261 E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin Sigma Aldrich T3705 E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2 Peprotech 100-18B E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin Life Technologies 12585-014 E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS Life Technologies 14190-144
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
Name Company Catalog Number Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
Alcian blue Sigma Aldrich A3157-10G
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252-25G
Safranin O Sigma Aldrich 090m0039v
Nuclear fast red Americanmastertech STNFR100 
xylene Duksan 115 
Ethanol Duksan 64-17-5
Mayer's hematoxylin solution wako pure chemical industries LAK7534
DAP VECTOR LABORATORIES SK-4100
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
Name Company Catalog Number Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM Life Technologies 11885 Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050 Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2 R&D 355-BM-050 Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3 R&D 243-B3-002 Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828-028 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix BD 354352 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble  Sigma Aldrich D2915-100MG Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement Life Technologies 35050-061 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution Sigma Aldrich S8636 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline Sigma Aldrich P5607-25G Chondrogenic media component (40μg/ml)

Referências

  1. van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future–lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
  2. Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
  3. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  4. Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
  5. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
  6. Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
  7. Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
  8. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  9. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  10. Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
  11. Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16 (2017).
  12. Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
  13. Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
  14. Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086 (2013).
  15. Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
  16. Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
  17. Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
  18. Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184 (2016).
  19. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144 (2015).
  20. Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
  21. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
  22. Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
  24. Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459 (2016).
  25. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  26. Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
  27. Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498 (2008).
  28. Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
  29. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  30. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
  31. Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
  32. Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
  33. Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
  34. Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
  35. Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
  36. Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786 (2016).
  37. Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
  38. Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal ‘stem’ cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
  39. Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
  40. Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213 (2008).
  41. Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
  42. Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
  43. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).

Play Video

Citar este artigo
Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55988, doi:10.3791/55988 (2017).

View Video