Summary

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Published: June 19, 2017
doi:

Summary

ここでは、臍帯血単核球由来ヒト由来多能性幹細胞からの軟骨分化のプロトコールを提案する。

Abstract

人間の関節軟骨は、それ自体を修復する能力が欠けている。従って、軟骨変性は治癒的ではなく、保存的治療によって治療される。現在、 エクスビボで増殖した軟骨細胞または骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)を用いて損傷軟骨を再生する努力がなされている。しかしながら、これらの細胞の制限された生存能力および不安定性は、軟骨再建におけるそれらの適用を制限する。ヒトに誘導された多能性幹細胞(hiPSC)は、再生的応用のための新しい選択肢として科学的な注目を集めている。無制限の自己複製能力と多能性を有することにより、hiPSCは、軟骨修復のための新しい置換細胞源として注目されている。しかし、高品質の軟骨形成性のペレットを大量に得ることは、臨床応用への大きな課題です。この研究では、胚様体(EB)由来の外胚葉細胞を軟骨分化のために使用した。成功した軟骨形成は、PCRおよびアルシアンブルー、トルイジンブルー、およびコラーゲンI型およびII型(それぞれCOL1A1およびCOL2A1)に対する抗体で染色した。我々は、臍帯血単核細胞由来iPSC(CBMC-hiPSC)の軟骨形成性ペレットへの分化のための詳細な方法を提供する。

Introduction

hiPSCsの使用は、薬物スクリーニングおよび種々の疾患の機械的研究のための新しい戦略を表す。再生的な観点から、hiPSCsはまた、関節軟骨1,2などの治癒能力が限定された損傷組織の置換のための潜在的な供給源でもある。

天然の関節軟骨の再生は、数十年にわたり挑戦されてきた。関節軟骨は柔らかく白い組織で、骨の端を覆い、摩擦から保護します。しかし、損傷したときの再生能力は限られており、自己修復はほとんど不可能である。したがって、数十年にわたって軟骨の再生に焦点を当てた研究が進行中である。

従来、軟骨形成系統へのインビトロ分化は、通常、膝関節から単離したBMSCまたは天然軟骨細胞を用いて行った3 。原因それらの軟骨形成能、BMSCおよび天然軟骨細胞は、軟骨形成におけるそれらの使用を支持する多くのメリットを有する。しかし、それらの限定された拡大および不安定な表現型のため、これらの細胞は、関節軟骨欠損の再構築にいくつかの限界に直面する。 インビトロ培養条件下では、これらの細胞は3-4継代後にそれら自身の特徴を失う傾向があり、最終的にそれらの分化能力に影響を及ぼす4 。また、天然軟骨細胞の場合、これらの細胞を得る際には、膝関節へのさらなる損傷が不可避である。

BMSCまたは天然軟骨細胞とは異なり、hiPSCはインビトロで無期限に増殖することができる。適切な培養条件では、hiPSCは軟骨分化の代替源として大きな可能性を秘めています。しかし、hiPSCの本質的な特性を変えることは難しい5 。さらに、それはいくつかの複雑なin vitro ste特定の細胞型にhiPSCsの運命を導くps。これらの合併症にもかかわらず、hiPSCsの使用は、自己複製能力が高く、軟骨細胞を含む標的細胞に分化する能力があるため、依然として推奨されている6

軟骨形成分化は、通常、MSC様前駆細胞を用いて、ペレット培養またはマイクロマス培養などの三次元培養系で行われる。 hiPSCを使用する場合、MSC様前駆細胞を生成するプロトコルは、既存のプロトコルとは異なる。いくつかのグループは、表現型をMSC様細胞に直接変換するために、hiPSCの単層培養を用いる。しかし、ほとんどの研究では、EBを用いてMSC8,9,10,11に似た外殖細胞を生成しています。

様々なタイプの成長因子を用いてコンドロゲを誘導するnesis。通常、BMPおよびTGFβファミリータンパク質は、単独でまたは組み合わせて使用​​される。分化は、GDF5、FGF2、およびIGF1などの他の因子によっても誘導されている12,13,14,15。 TGFβ1は、MSCs 16において用量依存的に軟骨形成を刺激することが示されている。他のアイソタイプであるTGFβ3と比較して、TGFβ1は、軟骨前軟骨間細胞の凝縮を増加させることによって軟骨形成を誘導する.TGFβ3は、間葉細胞増殖を有意に増加させることにより軟骨形成を誘導する17 。しかし、TGFβ3は、TGFβ1より研究者により頻繁に用いられる7,10,18,19。 BMP2は、ヒトにおける軟骨形成性マトリックス成分に関連する遺伝子の発現を増強するインビトロ条件下での関節軟骨細胞20 。 BMP2は、TGFβタンパク質21と組み合わせてMSCにおける軟骨形成に重要な遺伝子の発現を増加させる21 。 BMP2は、SmadおよびMAPK経路22を介してTGFβ3の効果を相乗的に増強することも示されている22

この研究では、CBMC-hiPSCを、低付着ペトリ皿中でEB培地を用いてEBに凝集させた。伸長細胞は、EBをゼラチンコートディッシュに付着させることによって誘導された。外胚葉細胞を用いた軟骨形成分化をペレット培養により行った。 BMP2およびTGFβ3の両方による処理は、細胞を首尾よく凝縮させ、軟骨形成ペレット形成のための細胞外マトリックス(ECM)タンパク質蓄積を誘導した。この研究は、CBMC-hiPSCを用いた単純で効率的な軟骨形成分化プロトコルを示唆している。

Protocol

このプロトコルは、カトリック大学(KC12TISI0861)の制度審査委員会によって承認された。再プログラミングに使用したCBMCは、ソウル・セント・メアリー病院の臍帯血バンクから直接入手した。 1. iPSCとの軟骨形成分化 CBMC-iPSC生成 先の研究23に示されたプロトコルを用いてCBMC-hiPSCを生成する。 血球を15 mLコニカルチュー?…

Representative Results

この研究では、EB細胞から伸長細胞を誘導することにより、CBMC-hiPSCから軟骨形成性ペレットを作製した。多分化能が高いことが確認されたCBMC-hiPSCを用いて軟骨形成分化を誘導した11 。我々のプロトコルの簡単なスキームを図1Aに示す 。分化の前に、iPSCコロニーを拡大した( 図1B )。拡大されたiPSCをEBと?…

Discussion

このプロトコルは、CBMCからhiPSCを首尾よく生成した。ヤマナカ因子24を含むセンダイウイルスベクターを用いて、CBMCをhiPSCに再プログラミングした24 。分化には3例を用い、すべての実験でこのプロトコールを用いて軟骨原性ペレットを作製した。多くの研究により、hiPSCの軟骨細胞への分化に関するプロトコールが報告されている25,26,27,28。しかし、CBMC-hiPS…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、韓国保健医療技術研究開発プロジェクト(HI16C2177)の助成を受けて行われました。

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP 93100
6-well Plate TPP 92006
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
Name Company Catalog Number Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES Life Technologies 11330-057 E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080-094 E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite Sigma Aldrich S5261 E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin Sigma Aldrich T3705 E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2 Peprotech 100-18B E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin Life Technologies 12585-014 E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS Life Technologies 14190-144
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
Name Company Catalog Number Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
Alcian blue Sigma Aldrich A3157-10G
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252-25G
Safranin O Sigma Aldrich 090m0039v
Nuclear fast red Americanmastertech STNFR100 
xylene Duksan 115 
Ethanol Duksan 64-17-5
Mayer's hematoxylin solution wako pure chemical industries LAK7534
DAP VECTOR LABORATORIES SK-4100
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
Name Company Catalog Number Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM Life Technologies 11885 Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050 Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2 R&D 355-BM-050 Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3 R&D 243-B3-002 Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828-028 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix BD 354352 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble  Sigma Aldrich D2915-100MG Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement Life Technologies 35050-061 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution Sigma Aldrich S8636 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline Sigma Aldrich P5607-25G Chondrogenic media component (40μg/ml)

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Citar este artigo
Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55988, doi:10.3791/55988 (2017).

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