Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone
Summary
Traditionele platengelektroforese (SGE) experimenten vereisen een ingewikkeld apparaat en een hoog chemisch verbruik. Dit werk bevat een protocol dat een goedkope methode om DNA-fragmenten te scheiden binnen een kort tijdsbestek beschrijft.
Abstract
Slabelelektroforese (SGE) is de meest voorkomende methode voor de scheiding van DNA-fragmenten; Zo wordt het ruim toegepast op het gebied van biologie en anderen. Het traditionele SGE-protocol is echter nogal vervelend, en het experiment duurt een lange tijd. Bovendien is het chemische verbruik in SGEO-experimenten zeer hoog. Dit werk stelt een eenvoudige methode voor de scheiding van DNA-fragmenten op basis van een SGE-chip voor. De chip wordt gemaakt door een gravure machine. Twee plastic bladen worden gebruikt voor de excitatie- en emissiegolflengten van het optische signaal. Het fluorescentie signaal van de DNA-banden wordt verzameld door de smartphone. Om deze methode te valideren werden 50 ladingen van 50, 100 en 1000 bp gescheiden. Uit de resultaten blijkt dat een DNA ladder kleiner dan 5000 bp binnen 12 minuten kan worden opgelost en met hoge resolutie bij gebruik van deze methode, hetgeen aangeeft dat het een ideale vervanging voor de traditionele SGE-methode is.
Introduction
Slabelelektroforese (SGE) is de meest effectieve methode voor DNA-fragment scheiding 1 , 2 , 3 , 4 , 5 en wordt dus beschouwd als een veelzijdig hulpmiddel in biochemische en biologische analyses 6 , 7 , 8 . Veel experimenten geven echter aan dat SGE beperkt is door de volgende vier problemen: (1) de scheidingen duurt vele uren en zelfs dagen; (2) het chemische verbruik is zeer hoog; (3) het vereist een ingewikkeld apparaat ( bijv. 2D elektroforese cel, elektroforese stroomvoorziening en gel imaging systeem); (4) het gel imaging systeem kan alleen de gescheiden DNA fragmenten waarnemen wanneer het experiment is afgerond. Bovendien wordt ethidiumbromide (EtBr), die algemeen gebruikt wordt in SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, is mutageen en kankerogeen 11 , 12 . Zo moeten handschoenen altijd gedragen worden bij het afleveren van gels die EtBr bevatten.
Capillaire elektroforese (CE) heeft talrijke voordelen 13 , 14 , 15 , 16 , 17 vergeleken met SGE, zoals automatische werking, korte scheidingstijd en lager verbruik. Het CE-instrument is echter vrij duur. Om deze beperkingen te overwinnen is derhalve een systeem ontwikkeld ( Figuur 1 ) voor de scheiding van DNA. Een dergelijk systeem kan niet alleen het chemische verbruik sterk verminderen en bespaart op de SGE-experimenttijd (<8 min), maar het kan ook real-time tracking van het DNA-scheidingsproces in de agarosegel door de smartphone uitvoeren. Door de procedures die in dit protocol worden beschreven, te volgen, zullen de leerlingen het volgende doenIk kan de SGE-chip ontwerpen en fabriceren, de agarosegel voorbereiden in de chip, een eenvoudig SGE-systeem opzetten met een smartphone en het DNA-migratieproces in de agarosegel opnemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Agarose gelelektroforese wordt wijd gebruikt voor de scheiding van DNA, RNA en eiwit. Dit werk stelt een nieuwe methode voor om het traditionele gelelektroforese protocol te vervangen. Resultaten tonen aan dat 50, 100 en 1000 bp DNA ladders goed kunnen worden gescheiden in zo'n klein gemonteerd apparaat. Het grote voordeel van deze methode is dat het niet alleen de nucleïnezuren kan scheiden met weinig chemisch verbruik, maar het kan ook het scheidingsproces opnemen. Hoewel de DNA-fragmenten breed in <strong class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen dankbaar steun van de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (nr. 21205078) en het Onderzoeksfonds voor het doctoraal programma van het hoger onderwijs in China (No.20123120110002). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Key Research and Development Programme van China (2016YFB1102303), het Nationaal Basisonderzoeksprogramma van China (973Programma, 2015CB352001) en de National Natural Science Foundation of China (61378060).
Materials
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 |
| 50bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A |
| 100bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A |
| 1kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
Referências
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
