Il metodo di isola è un relativamente nuovo, conveniente che può essere utilizzato per valutare il comportamento motorio di base di Drosophila melanogaster. Questo manoscritto descrive algoritmi per l’elaborazione dei dati automatica e quantificazione obiettiva dei dati di analisi isola, rendendo questo saggio una lettura sensibile, ad alta produttività per grandi schermi di genetici o farmacologici.
Progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione contribuiscono all’identificazione di geni-malattia (candidato) per disturbi del movimento e altre malattie neurologiche a una velocità crescente. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa i meccanismi molecolari che sono alla base di questi disordini. Casella degli strumenti genetico, molecolare e comportamento di Drosophila melanogaster rende questo organismo di modello particolarmente utile per la caratterizzazione di nuovi geni-malattia e meccanismi in un modo ad alta velocità. Tuttavia, schermi ad alta velocità richiedono dosaggi efficienti ed affidabili che, idealmente, sono convenienti e consentire per la quantificazione automatizzata dei tratti rilevanti per questi disturbi. Il dosaggio di isola è un conveniente e facilmente il set-up metodo per valutare il comportamento motorio della drosofila . In questo saggio, mosche sono gettati in una piattaforma da un’altezza fissa. Questo induce una risposta motoria innata che consente le mosche fuggire dalla piattaforma in pochi secondi. Allo stato attuale, analisi quantitative di girato isola saggi sono fatto manualmente, che è un’impresa laboriosa, in particolare quando si eseguono grandi schermi.
Questo manoscritto descrive gli algoritmi“Drosophila isola Assay” e “Isola test Analysis” per high throughput, trattamento automatizzato di dati e la quantificazione dei dati di analisi di isola. Nell’impostazione di una semplice webcam collegata a un computer portatile raccoglie una serie di immagini della piattaforma mentre il test è eseguito. L’algoritmo di“Drosophila isola Assay” sviluppato per il software open-source Fiji elabora queste serie di immagine e quantifica, per ogni condizione sperimentale, il numero di mosche sulla piattaforma nel corso del tempo. Lo script di “Isola test Analysis”, compatibile con il software gratuito R, è stato sviluppato per elaborare automaticamente i dati ottenuti e per calcolare se trattamenti/genotipi sono statisticamente differenti. Questo notevolmente migliora l’efficienza del test isola e rende una lettura potente per base locomozione e comportamento in volo. Così può essere applicato a grandi schermi indagando volare capacità dell’apparato locomotore, Drosophila modelli di disturbi del movimento e l’efficacia dei farmaci.
Negli ultimi anni, i progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione hanno notevolmente contribuito all’identificazione di geni alla base di disturbi del movimento degenerativa del cervello (per esempio, l’atassia cerebellare e morbo di Parkinson), di un neurone periferico origine (ad esempio, la sclerosi laterale amiotrofica e la paraplegia spastica ereditaria) e di origine muscolare (ad es., distrofia muscolare di Duchenne e la distrofia miotonica)1,2,3,4 . Nonostante questo, piccolo è conosciuto circa i meccanismi molecolari che sono alla base della maggior parte di questi disturbi. Una migliore comprensione di questi meccanismi è essenziale per lo sviluppo di terapie.
Come nell’uomo, il movimento negli organismi di modello, come volo e locomozione in Drosophila, è controllato dalla centrale del cervello, sistema nervoso periferico e muscoli. Inoltre, il tempo di generazione veloce e toolbox genetica della drosofila rendono questo organismo di modello particolarmente adatto per lo screening di alto-rendimento di geni coinvolti nei disordini di movimento e per droga test5,6 . A causa del notevole numero di condizioni che devono essere testati in tali schermi, affidabili, convenienti e relative analisi semplice, come pure strumenti per quantificare i risultati di uscita in modo automatico, sono altamente desiderabili.
Schmidt et al. (2012) 7 descritto un test di basso costo chiamato il “saggio di isola” per valutare il comportamento motorio della drosofila . Il dosaggio di isola è stato utilizzato con successo in proiezioni su larga scala per identificare geni con funzioni specifiche glia7, nella valutazione dei modelli di Drosophila di disabilità intellettiva8e per la valutazione generale di volare il comportamento del motore9. Il disegno di principio del dosaggio isola consiste di una piattaforma elevata sul quale vengono generate diverse mosche. Questo induce un innato comportamento motore che consente sani mosche fuggire dalla piattaforma in pochi secondi. Il test misura il numero di mosche restanti sulla piattaforma sopra tempo7,8,9. Tutte queste caratteristiche indicano che il dosaggio di isola può essere uno strumento di screening potente per geni coinvolti nei disordini di movimento.
Attualmente, l’analisi quantitativa dei dati di analisi filmata isola avviene manualmente7,8,9. Per migliorare l’efficienza del test, un metodo di basso costo è stato sviluppato per quantificare semi-automaticamente la fuga di mosche dalla piattaforma. Il programma di installazione utilizza una semplice webcam collegata a un computer portatile per raccogliere tempo immagine serie della piattaforma, con fotogrammi acquisiti ogni 0,1 s. telai vengono poi elaborati con la macro“Drosophila isola Assay” che quantifica il numero di mosche sulla piattaforma sopra tempo. La macro“Drosophila isola Assay” è diviso in tre sub-macro indipendente: (I) il “Crea stack e proiezione,” Sub-macro identifica gli esperimenti differenti dell’isola memorizzati in diverse sottocartelle e crea uno stack e una proiezione di ciascuno serie temporali. (II) la Sub-macro “Piattaforma di definire” consecutivamente aprirà tutti i file “Projection_image_name.tif” presenti nelle singole sottocartelle sperimentale, al punto che all’utente è richiesto di definire manualmente la piattaforma dell’isola come la regione di interesse (ROI). (III) “analisi” quantifica automaticamente il numero di mosche restanti sulla piattaforma durante la serie temporale. Il sub-macro possono essere eseguite consecutivamente (in una sola volta) o in modo indipendente. Per l’analisi di dati statistici, uno script è stato sviluppato per elaborare automaticamente i dati ottenuti e applicare un test statistico per determinare se trattamenti/genotipi comportarsi significativamente differente da altro (Figura 1). Infine, è dimostrato che questa configurazione può essere utilizzata per valutare e quantificare la capacità dell’apparato locomotore aberrante di un modello di Drosophila per l’atassia-telangiectasia (AT).
Questo protocollo descrive la macro“Drosophila isola Assay” che valuta quantitativamente il comportamento motorio Drosophila durante il dosaggio di isola. La macro conta con precisione le mosche sulla piattaforma nel corso del tempo, rendendo il dosaggio di isola altamente sensibile e adatto per la valutazione quantitativa di alto-rendimento dei difetti dell’apparato locomotore. La metodologia consente il confronto di qualsiasi condizione, con mosche cresciuti sotto differenti condizioni ambientali e/o genetiche, compreso esposizione al farmaco. Questa indicazione è dunque particolarmente utile come strumento di scoperta durante l’esecuzione di grandi schermi genetici o farmaceutici, quando studiare modelli di Drosophila dei disturbi del movimento e altre malattie neurologiche, o esaminando la locomozione o volo comportamento.
Il protocollo di dosaggio isola presentato in questo manoscritto fornisce vantaggi rispetto ai metodi esistenti/alternativa. Ad esempio, il video-monitoraggio locomozione è richiede molto più tempo e meno adatto per testare campioni di grandi dimensioni. Il dosaggio di isola è uno strumento di screening ad alta resa e, in questo senso, è paragonabile al dosaggio rapido interattiva geotassi negativa (anello)16. La differenza tra i due è che i saggi di isola consente il rilevamento di una più vasta gamma di problemi dell’apparato locomotore; l’incapacità di mosche di lasciare la piattaforma può essere causato da difetti in volo, salto, o camminare comportamento causato da ala (muscolo/neuronali) e/o gamba (muscolo/neuronali) difetti. D’altra parte, l’analisi dell’anello valuta difetti nel comportamento di arrampicata/a piedi causate da difetti della gamba (muscolo/neuronali). Nel caso in cui gli utenti sono interessati a più letture del comportamento, il dosaggio di isola è anche perfettamente combinabile con altri dosaggi, ad esempio, il saggio di anello. Inoltre, laser necessario per optogenetica possono essere facilmente installati nella finestra di analisi isola, e l’installazione è così semplice che può essere facilmente spostato in una camera dove la temperatura e la luce può essere controllate.
Per garantire il successo e la riproducibilità del dosaggio isola descritto qui, una serie di raccomandazioni devono essere seguite. Aliquotare e trasferimento le mosche alla prova sperimentale fiale presso almeno un giorno prima dell’esperimento per evitare gli effetti dell’anestesia di CO2 o freddo. Non sovraffollamento le fiale sperimentale (uso 10-15 mosche per flaconcino; si consiglia di inserire sempre lo stesso numero di mosche per flaconcino). Tenere le mosche sul cibo fresco in ogni momento. Se non ancora familiarità con lo svolgimento di test, pratica gettando vola sulla piattaforma per massimizzare il rendimento. Anche la pratica rapidamente ritraendo la mano subito dopo, poiché interferisce con l’analisi dei dati (analisi dell’immagine e Vola conteggio inizio solo dopo che la mano è fuori dal quadro). Mantenere le condizioni ambientali e sperimentali identiche in esperimenti che devono essere confrontati (ad es., controlli contro mutanti o un genotipo testato alle età differenti). Sempre eseguire gli esperimenti allo stesso tempo del giorno e mantenere i flaconcini in condizioni di umidità e temperatura controllata. Per potere statistico, test tecnici almeno tre repliche per replica biologico.
Per garantire il buon funzionamento della macro descritto qui, impostazioni webcam e l’immagine devono essere regolate per ottenere il massimo contrasto: mosche che appaiono come oggetti neri su una piattaforma di bianco. Quando il numero di mosche non è conteggiato correttamente dalla macro, regolare le impostazioni di contrasto, controllare se il ROI è selezionato correttamente e assicurarsi che la dimensione delle mosche sulla piattaforma è superiore al valore minimo specificato volare impostazione dimensione (Vedi punto 8.3 del presente protocollo). Le impostazioni devono solo essere definito una sola volta. Sono applicabili a tutti gli esperimenti, come la distanza tra le webcam e la piattaforma non è cambiata. I Circularity_min e le impostazioni max definiscono la circolarità delle particelle (particelle = contati mosche) che si terrà in considerazione per l’analisi (mosche = oggetti contati). 1 rappresenta un cerchio perfetto e 0 rappresenta una linea17. Dal momento che le mosche sempre presentano un certo grado di circolarità (una Mosca non può apparire come una linea retta), il “Circularity_max” è impostata a 1 e l’impostazione “Circularity_min” è impostata a 0.4. È improbabile che l’utente deve modificare queste impostazioni.
La macro fa occasionalmente conteggio errori quando una Mosca si trova vicino al bordo della piattaforma. Ciò può verificarsi se le mosche non possono volare ma a piedi dentro e fuori il ROI definito dall’utente. Nella maggior parte dei casi, riselezionare il ROI (inserendolo per quanto possibile alla piattaforma) puoi risolvere facilmente questo problema. Tuttavia, lo script di “Isola analisi analisi” è in grado di rilevare e conteggi dati corretti improprio causato da mosche camminare dentro e fuori il ROI relativamente bene. Anche se la risoluzione della webcam presentato qui è abbastanza alta per discriminare mosche nelle immediate vicinanze abbastanza bene, abbiamo implementato algoritmi aggiuntivi nella procedura di elaborazione di immagine macro“Drosophila isola Assay”, come la spartiacque ed erodere la funzione17. Questi facilitano la corretta delineazione di mosche che sono in stretta vicinanza sulla piattaforma. Inoltre, la macro è in grado di distinguere tra mosche che saltò dalla piattaforma o volarono lontano da esso. Tuttavia, generalmente si è osservato che sani giovane ceppi volare volano via immediatamente quando è sceso sulla piattaforma, mentre più grandi mosche e mosche con deficit motorio restano più a lunghi sulla piattaforma e verranno alla fine saltare o cadere dalla piattaforma. Nonostante queste limitazioni, il dosaggio e analisi forniscono una misura molto accurata del comportamento motorio.
Per garantire la performance di successo dello script “Isola test Analysis”, l’utente deve assicurarsi di immettere i percorsi corretti per i file di input e outpui delle righe di script indicato nel protocollo e di fornire i dati nel formato di cartella corretta (come indicato nella Figura 2). Se l’utente rileva che i criteri utilizzati per filtrare i dati sperimentali inaffidabili troppo stringenti (riga 68: il primo valore nella colonna “Count” è minore o uguale a 5; row 71: il primo valore nella colonna “Count” è superiore al numero totale di mosche generata sulla platfo RM + 3), spegnere queste impostazioni filtro aggiungendo un # davanti il testo nelle righe 68 e 71 nello script “Isola test Analysis”. In questo caso, tutti i set di dati verrà essere inclusi nell’analisi. In alternativa, è possibile modificare le impostazioni di filtro modificando i valori nelle righe 68 e 71 secondo i bisogni di utente. Possibili artefatti nei valori totali nella “results. txt” generato dalla macro“Drosophila isola Assay” possono anche essere regolati manualmente, e può eseguire nuovamente lo script sui dati impostati. Quando l’utente è interessato a l’elaborazione di più di 10 fps o più di 10 s di dati, il numero di fotogrammi elaborati dallo script “Isola analisi analisi” dovrebbeessere regolata. L’analisi statistica può essere sostituito anche da alternative definite dall’utente.
Una cartella denominata “Esempi isola Assay,” contenente esempi con tempo-serie di immagini ottenute mediante il saggio dell’isola, può essere trovata presso il seguente sito Web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Scarica il folder “Esempi isola Assay” e seguire i passaggi descritti nel presente protocollo per diventare rapidamente familiarizzato con la struttura di archiviazione di file, l’elaborazione delle immagini con la macro “Dosaggio di Drosophila Island” e il “isola analisi analisi” script.
Il dosaggio di isola, in combinazione con la macro sviluppata e script di analisi, può essere utilizzato per valutare e quantificare il comportamento del movimento aberrante di un modello di Drosophila dell’Atassia-Telangiectasia. Poiché il test può essere applicato in modo efficiente a varie età, è adatta ad analizzare la natura potenzialmente progressiva dei fenotipi.
In sintesi, il dosaggio di isola, in combinazione con la macro“Drosophila isola Assay” e lo script di “Isola test Analysis”, è un dosaggio conveniente, affidabile e altamente efficiente per oggettivamente analizzare e quantificare i difetti dell’apparato locomotore di Drosofila modelli di disordini di movimento in un modo ad alta velocità.
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo la drosofila Resource Center di Vienna e il centro stock Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537) per la fornitura di ceppi di Drosophila . Siamo grati al laboratorio Klämbt per introdurre noi per il dosaggio di isola e Martijn Eidhof per la costruzione l’installazione di dosaggio di isola. Questo studio è stato in parte sostenuto dal E-RARE-3 Call transnazionale comune concedere “Preparazione di terapie per le atassie autosomiche recessive” PREPARE (NWO 9003037604), da una sovvenzione superiore (912-12-109) l’organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) e di due borse di studio dottorato DCN/Radboud University Medical Center. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.
25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | – |
Logitech C525 HD Webcam | Logitech | – | Any webcam with USB connection is suitable. |
Stand to hold webcam | – | – | – |
Lamp | – | – | 12 V LED lights are appropriate |
Pounding pad | – | – | Any mouse pad works |
Island Assay box | – | – | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20×30 cm. Transparent. |
Island Assay bath | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
Island/platform | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
Soap | – | – | Standard dishwashing detergent is suitable. |
Computer | – | – | Scripts run both on Windows and Mac |
Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | – | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
Image-recording software: WebcamCapture | – | – | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
Fiji | – | – | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
R studio | – | – | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
R | – | – | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |