High-throughput analyse van Locomotor gedrag in de Drosophila eiland Assay
Summary
De bepaling van het eiland is een relatief nieuwe, rendabele test die kan worden gebruikt voor het evalueren van de fundamentele motorische gedrag van Drosophila melanogaster. Dit manuscript wordt beschreven algoritmen voor automatische gegevensverwerking en objectieve kwantificering van eiland assay gegevens, waardoor dit een gevoelige en high-throughput uitlezing voor grote genetische of farmacologische schermen assay.
Abstract
Vooruitgang in de volgorde van de volgende generatie technologieën bijdragen tot de identificatie van de (kandidaat-) ziekte genen voor bewegingsstoornissen en andere neurologische ziekten met een toenemende snelheid. Echter, er is weinig bekend over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze aandoeningen. De genetische, moleculaire en behavioral werkset van Drosophila melanogaster maakt dit model-organisme bijzonder nuttig te karakteriseren van nieuwe genen van de ziekte en mechanismen in een high-throughput wijze. High-throughput schermen vereisen echter efficiënte en betrouwbare tests, die idealiter kosteneffectiever zijn en zorgen voor de geautomatiseerde kwantificering van eigenschappen relevant zijn voor deze aandoeningen. De bepaling van het eiland is een kosteneffectieve en gemakkelijk set-up method to evaluate methode Drosophila locomotor gedrag. In deze test, worden vliegen geworpen op een platform van een vaste hoogte. Dit induceert een aangeboren motor antwoord waarmee de vliegen om te ontsnappen aan het platform binnen seconden. Op dit moment zijn kwantitatieve analyses van gefilmd eiland tests handmatig gedaan, dat is een moeizame onderneming, met name bij het uitvoeren van grote schermen.
Dit manuscript wordt de“Drosophila eiland Assay” en “Eiland Assay Analysis” algoritmen voor hoge-doorvoer geautomatiseerde gegevensverwerking en kwantificering van eiland assay gegevens beschreven. In het configuratiemenu verzamelt een eenvoudige webcam aangesloten op een laptop een afbeelding-reeks van het platform, terwijl de bepaling wordt uitgevoerd. De“Drosophila eiland Assay” algoritme ontwikkeld voor de open-sourcesoftware Fiji verwerkt deze afbeelding serie en kwantificeert, experimentele voorwaarde, het aantal vliegen op het platform na verloop van tijd. Het “Eiland Assay Analysis” script, compatibel met de gratis software R, werd ontwikkeld voor het automatisch verwerken van de verkregen gegevens en om te berekenen of behandelingen/genotypen statistisch verschillend zijn. Dit aanzienlijk verbetert de efficiency van de bepaling van het eiland en maakt het een krachtige uitlezing voor fundamentele motoriek en vlucht gedrag. Het kan dus worden toegepast op grote schermen onderzoeken vliegen locomotor vermogen, Drosophila modellen van bewegingsstoornissen en werkzaamheid van het geneesmiddel.
Introduction
In de afgelopen jaren hebben vooruitgang in de volgorde van de volgende generatie technologieën bijgedragen tot de identificatie van genen onderliggende degeneratieve bewegingsstoornissen van de hersenen (bijvoorbeeld cerebellaire ataxie en Parkinson), apparaat neuronale oorsprong (bijvoorbeeld Amyotrofische laterale sclerose en erfelijke spastische dwarslaesie), en gespierde oorsprong (bijvoorbeeld de spierdystrofie van Duchenne en de myotone dystrofie)1,2,3,4 . Ondanks dit, er is weinig bekend over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het merendeel van deze aandoeningen. Een beter begrip van deze mechanismen is essentieel voor de ontwikkeling van therapieën.
Zoals mensen, in wordt beweging in modelorganismen, zoals vlucht en motoriek in Drosophila, beheerd door de centrale hersenen perifeer zenuwstelsel en de spieren. Bovendien, maken de snelle generatietijd en genetische toolbox van Drosophila dit model-organisme bijzonder geschikt voor de high-throughput screening van genen betrokken in bewegingsstoornissen en voor drugstests5,6 . Wegens het aanzienlijke aantal voorwaarden die worden getest in dergelijke schermen, betrouwbare, rendabele, en relatief eenvoudige tests, alsmede de instrumenten moeten te kwantificeren van de uitvoerresultaten op een geautomatiseerde manier, zijn zeer wenselijk.
Schmidt et al. (2012) 7 beschreven een low cost-test genoemd de “eiland assay” om te evalueren van Drosophila locomotor gedrag. De bepaling van het eiland is met succes in grootschalige screenings gebruikt om genen te identificeren met glia-specifieke functies7, bij de evaluatie van Drosophila modellen van verstandelijke beperking8, en voor de algemene evaluatie van motor probleem9vliegen. Het ontwerp van het principe van de bepaling van het eiland bestaat uit een verhoogde platform waarop verschillende vliegen zijn gegooid. Dit induceert een aangeboren motor gedrag waarmee gezonde vliegen om te ontsnappen aan het platform binnen seconden. De test meet het aantal vliegen nog op het platform over tijd7,8,9. Al deze functies aangeven dat de bepaling van het eiland een krachtige screening tool voor genen betrokken bij bewegingsstoornissen kan zijn.
Op dit moment is de kwantitatieve analyse van gefilmd eiland assay gegevens handmatig7,8,9gedaan. Ter verbetering van de efficiëntie van de test, werd een goedkope methode ontwikkeld om semi-automatisch het kwantificeren van het ontsnappen van vliegt vanaf het platform. De setup een eenvoudige webcam aangesloten op een laptop gebruikt voor het verzamelen van beeld destijds serie van het platform, met frames verworven elke 0,1 s. Frames worden vervolgens verwerkt met de macro“Drosophila eiland Assay” kwantificeert het aantal vliegen op het platform over tijd. De macro“Drosophila eiland Assay” is verdeeld in drie onafhankelijke sub macro’s: (I) de “maken stack en projectie,” sub macro identificeert verschillende eiland experimenten in verschillende submappen opgeslagen en creëert een stack en een projectie van elk tijdreeksen. (II) de “Definiëren Platform” sub macro verschijnt achtereenvolgens alle bestanden van de “Projection_image_name.tif” gelegen in de individuele experimentele submappen, op dat moment wordt de gebruiker gevraagd het eilandstation handmatig te definiëren als de regio van belang (ROI). (III) “analyse” kwantificeert automatisch het aantal vliegen tijdens de tijdreeksen op het platform blijven. De sub macro’s kunnen worden uitgevoerd achter elkaar (in een punt) of onafhankelijk. Voor statistische gegevensanalyse ontstond een script voor het automatisch verwerken van de verkregen gegevens en toe te passen van een statistische toets om te bepalen of behandelingen/genotypen beduidend verschillend van elkaar (Figuur 1 gedragen). Tot slot wordt aangetoond dat deze opstelling kan worden gebruikt voor het evalueren en kwantificeren van de afwijkende locomotor vermogen van een model van de Drosophila voor Ataxie-Teleangiëctasie (AT).
Protocol
- De instellingen aanpassen in de " tijd-tijdspanne film Setup " het experiment als een AVI-bestand opslaan. Klik op " bladeren …, " Selecteer de map waarin u de film wilt opslaan, definieert de naam van de video en druk op " opslaan. " Opmerking: de video-bestand wordt niet gebruikt voor het kwantificeren van gegevens; het kan echter zinvol zijn om een algemeen idee te krijgen over het experiment. De instellingen aanpassen in de " tijd-tijdspanne film Setup " sectie. Selecteer in het vak compressie " Intel IYUV code " voor videocompressie en kies " nemen één frame om de 0,1 seconden, " met de " afspelen snelheid (beelden per seconde): " aan 10. De tijdreeks experiment als .bmp frames opslaan door te klikken op " Geavanceerd … " Selecteer " een BMP-afbeelding maken voor elk frame gevangen. " Klik op " bladeren. " Selecteer dezelfde map in de " tijdens AVI film opname " venster (als gekozen in stap 6.1), klik op " Open, " en druk op " Ok. " Opmerking: merk op dat tijdens het experiment, de frames worden opgeslagen als BMP-bestanden (vereist voor data-analyse). Het programma namen de frames als " A " gevolgd door het nummer dat overeenkomt met de framereeks vastleggen (bijvoorbeeld, " A_number.bmp ") ( figuur 2C). Altijd sla de afbeeldingen die behoren tot verschillende experimenten in een nieuwe map om ervoor te zorgen dat eerder opgenomen beeld-serie worden niet overschreven. Let erop dat de beelden niet automatisch in dezelfde map als het videobestand opgeslagen worden tenzij deze map is geselecteerd onder " bladeren … " op het te klikken op de " Geavanceerd " vak. 7. Eiland Assay en gegevensverzameling Druk op de startknop in de interface van de time-lapse beeld van de beeldopname software om de opname te starten. Tik op de experimentele flacon met vliegen (stap 3) 2 – 3 keer om ervoor te zorgen dat de vliegen aan de onderkant van de flacon zijn. Snel verwijderen van de stekker van de flacon en met een krachtige beweging, tik op het flesje op het perron zodat alle vliegen op het platform op hetzelfde moment ( Figuur 1 c vallen). Na ongeveer 30 s, druk op de " stoppen " knop opnemen te stoppen. Opmerking: Als alle vliegen uit het platform verdwijnen, de opname kan worden gestopt eerder. Verwijderen van de vliegen die 30 gedurende s op het platform met de hand na het stoppen van de beeldopname. Wijzigen voordat u voor het opnemen van het volgende experiment, de folder van het doel voor de BMP-bestanden en films (zie punt 6). 8. Gegevensverwerking: Uitvoeren van de " Drosophila eiland Assay " Macro Opmerking: Zie Figuur 1 d. Lopen de " maken van de stack en projectie " sub macro ik stapels en prognoses van de verzamelde foto-serie te produceren. Start Fiji, klik op " Plugins " in de werkbalk en koos " Drosophila eiland Assay " in het dropdown menu; een nieuw venster zal verschijnen. Enter de " eerste beeld tijdreeksen id " instellen in de grafische interface van macro. Opmerking: De opgenomen beeld frames worden opgeslagen als " A-number.bmp " volgens de volgorde waarin de beelden worden verkregen. In de " eerste frame id " macro interface, vul in de instelling met het getal dat het eerste frame van het programma en met de extensie. Vul " eerste frame id " met "-0001.bmp, " aangezien het eerste frame heet " A-0001.bmp " ( figuur 2C). In het geval dat andere beeldformaten (zoals .tiff of .jpeg) worden gegenereerd door de webcamsoftware, geef de juiste bestandsextensie van de eerste afbeelding in " eerste beeld tijdreeksen id. " selecteert u alleen de " maken van de stack en projectie " sub macro, klik op " Ok, " en selecteer de hoofdmap waarin alle submappen met individuele eiland assay experimenten. Opmerking: De BMP-bestanden in elk individu experimenteren map waarin de " eerste frame id " zal vervolgens worden verwerkt. Twee nieuwe bestanden worden weergegeven in elke afzonderlijke experiment submap, standaard de naam " Stack_image_name.tif " en " Projection_image_name.tif " ( Figuur 1 d). Zodra deze stap wordt uitgevoerd, kunnen de BMP-bestanden worden verwijderd. Stack en projectie .tif-bestanden bevatten alle gegevens en zijn voldoende voor verdere analyse. Lopen de " definiëren Platform " sub macro II de exacte locatie van het platform selecteren. Openen van de grafische interface van de " Drosophila eiland Assay, " selecteert u alleen de " definiëren platform " checkbox en druk op " Ok. " In de " Kies een map " venster, selecteer de hoofdmap waar experimentele submappen zijn opgeslagen en druk op " Select. " Opmerking: de " definiëren Platform " sub macro zoekt automatisch naar " Projection_image_name.tif " bestanden in alle submappen in de hoofdmap opgeslagen. De " Projection_image_name.tif " afbeelding die is opgeslagen in de eerste map, samen met twee vensters — " bepalen het platform " en " ROI manager " — zal openen. Selecteer de " veelhoek selecties " gereedschap op de werkbalk Tekenen een selectie die overeenkomt met het eilandstation. Opmerking: Het is zeer belangrijk uit te sluiten van de grens van het platform van de selectie. Zie figuur 2D. Na het selecteren van het platform in de eerste afbeelding, klik op " toevoegen " in de " ROI Manager " venster, het geselecteerde gebied wordt weergegeven in het venster van de manager ROI als een set van waarden ( figuur 2D). Druk op " Ok " in het " definiëren van het platform " venster. De macro zal overgaan tot de volgende projectie. Klik op de nummers ( figuur 2D) opgeslagen in de " ROI manager " venster, de vorige selectie wordt vervolgens automatisch weergegeven in de huidige afbeelding projectie. Opmerking: sinds het eiland platform dreigt te doen hetzelfde formaat en dezelfde positie wanneer experimenten worden uitgevoerd in een rij (zolang de positie van de webcam en het eiland ongewijzigd blijven), is het nuttig om op te slaan van de ROI definiëren van het platform in de " ROI manager. " door Hierdoor bespaart de gebruiker tijd; in de aankomende projecties, het is alleen noodzakelijk om te klikken op de tijdelijk opgeslagen selectie in de manager van de ROI. Als de positie van het eiland iets ten opzichte van naar het vorige experiment verplaatst heeft, de positie van de selectie aanpassen door links in het midden van de selectie te klikken en te slepen het geselecteerde gebied naar de gewenste positie. Als de selectie niet met het platform overeen komt, klik met de linkermuisknop buiten de selectie te doen en een nieuwe selectie voor het gebruik van het platform af te bakenen de " veelhoek selectie " gereedschap. De nieuwe selectie opslaan in de ROI-manager door te klikken op " toevoegen; " een nieuwe selectie verschijnt in het " ROI manager " venster die kan worden gebruikt voortdurend. Wanneer de selectie is aangepast, klik op " Ok " in het " definiëren van het platform " venster en herhaal de procedure totdat alle platformen zijn gedefinieerd. Opmerking: Merk op dat een binaire image van het platform dat overeenkomt met het afgebakende gebied van ROI in wit op een zwarte achtergrond, met de naam " Platform_image_name.tif, " verscheen voor elke verwerkte beeld in dezelfde experimentele submap als de stack en projectie afbeeldingen gegenereerd stap 8.1.3 ( Figuur 1 d). Definiëren de vliegen minimumgrootte. Opmerking: Deze instelling bepaalt de minimale vliegen grootte in pixels. Deeltjes die kleiner dan de opgegeven minimale grootte zijn zal worden uitgesloten van de analyse om te voorkomen dat valse positieven als gevolg van lawaai. Open een afbeeldingsstapel gemaakt door de " maken van de stack en projectie " sub macro I. Converteren de afbeeldingsstapel naar 8-bit door te klikken op afbeelding > > Type > > 8-bit. Ga naar het menu, drukt u op afbeelding > > aanpassen > > drempel, zorg ervoor dat de " donkere achtergrond " vak is geselecteerd en druk op " toepassen; " een tweede venster genaamd " drempel " zal verschijnen. Klik op " donkere background " en druk op " Ok. " Opmerking: een binaire afbeeldingsstapel ontstaat waarin de vliegen zijn gedefinieerd in het platform in wit en zwart. Wanneer dit niet het geval, van toepassing de " omkeren " functie door te klikken op bewerken > > omkeren > > uitvoeren. Stel de schaal om het aantal pixels kan worden opgespoord door te klikken op analyseren > > schaal instellen. De volgende instellingen toe te passen: afstand in pixels = 1, bekend van afstand = 1, pixelverhouding = 1, en de eenheid van lengte = pixel. Druk op " Ok. " Selecteer de " Wand " (tracing) gereedschap in de werkbalk en klik op een vlieg (zwarte) aanwezig op het perron. Druk op ctrl + m (Windows-gebruikers) of cmd + m (Mac-gebruikers); een nieuwe " resultaten " venster geeft het gebied van de geselecteerde plek in pixels. Hiervoor achtereenvolgens voor verschillende vliegen en bepalen de vliegen minimumgrootte. Opmerking: Wanneer u de macro uitvoert, stelt u de " vliegen minimumformaat " instelt op de kleinste waargenomen vliegen grootte minus een marge van 10%. ( figuur 2E). Lopen de " analyse " sub macro III te kwantificeren vliegt het platform ontsnappen. Ga naar de werkbalk, selecteer " Plugins, " en koos de " Drosophila eiland Assay. " aanpassen de " vliegen minimumformaat " instellen volgens de waarde die is gedefinieerd in stap 8.3. Opmerking: Gebruik de waarde gedefinieerd in stap 8.3 alleen als de standaard instelling van " vliegen minimumformaat " zorgt ervoor dat uitsluiting van vliegen die waren aanwezig op het platform of als de macro achtergrond signaal speurder zoals vliegen. In de " aantal vliegen per flacon " instellen, vult u het maximum aantal vliegen in de flesjes aanwezig tijdens het volledige experiment. Als een experiment heeft flesjes met 15 vliegen, anderen met 20 vliegen en anderen met 23 vliegen, bijvoorbeeld de " aantal vliegen per flacon " moet worden vermeld als 23. Selecteer de " analyseren " checkbox en druk op " Ok; " een nieuwe " Kies een map " venster zal verschijnen. Selecteer de hoofdmap (met alle submappen en bestanden binnen) en druk op " select. " Opmerking: de macro zal analyseren alle afbeeldingen in de submappen opgeslagen zolang ze bevatten de " stack_image_name, " " Projection_image_name, " en " Platform_image_name " bestanden. De macro zal het verwerken van beeld naar beeld. De macro uitvoer bestaat uit een binair resultaat afbeeldingsstapel genaamd “ result_stack_subfolder_name.tif ” en een resultaat-tekstbestand genaamd " result_subfolder_name.txt, " die worden weergegeven in elke map gegevens. het resulterende tekstbestand (.txt) bevat kwantitatieve metingen overeenkomt met de afbeelding stack en bestaat uit 9 kolommen. De inhoud van deze kolommen is samengevat in tabel 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " komt overeen met de afbeelding-tijdreeksen van een experiment, waar vliegen gedetecteerd tijdens het experiment worden weergegeven als zwarte stippen op een witte achtergrond ( figuur 1E). Zorgvuldig inspecteren de stack resultaat om ervoor te zorgen dat er geen artefacten hebben plaatsgevonden en dat de macro nauwkeurig gewerkt ( figuur 2F). Opmerking: Voorbeelden van artefacten kunnen beeldelementen die niet vliegt maar die als zodanig worden gedetecteerd door de afbeelding segmentatie algoritme (valse positieven). Dit kan, bijvoorbeeld, zijn als gevolg van detectie van achtergrond signaal vanwege een onjuiste selectie van de ROI. 9. Data analyse met behulp " eiland Assay analyse " structuur de gegevens zoals aangegeven in de figuur 2A tot analyse met de " eiland Assay analyse " script. Genereren van een hoofdmap met submappen, waarbij elke submap die overeenkomt met een experimentele voorwaarde te analyseren. In de submappen, het genereren van mappen die bevatten de onafhankelijke experimentele replicatieonderzoeken ( figuur 2A) en de bestanden van de results.txt geproduceerd door de " Drosophila eiland assay " macro. Opmerking: De " eiland Assay analyse " macro zal alle proefomstandigheden, gelegen in de hoofddirectory tegelijk verwerken. Start R of R-studio. Tikken voort vijl > > Open bestand … in de werkbalk en selecteer de " eiland Assay analyse " script. Install pakketten bij het uitvoeren van de ggplot2 en de matrixStats de " eiland Assay analyse " script voor de eerste keer. Typ het volgende in het consolevenster: > install.packages("ggplot2"), Voer > install.packages("matrixStats"), voer. Geef de locatie van de gegevens en analyses output-in het script bestanden. In het volgende script rijen invoegen: rij 16: invoegen van het pad naar de hoofdmap waarin de experimenten worden geanalyseerd en vergeleken (in figuur 2A, dit is het pad leiden naar de " eiland Assay " map). Rij 19: invoegen van het pad naar de map waarin de analyse output bestanden zijn opgeslagen. Opmerking: De map aangegeven in rij 16 kan alleen bevatten de mappen moeten worden geanalyseerd. Het script ook werkt niet goed als hetzelfde zijn de paden ingevoegd in de rij 16 en rij 19. Het script uitvoeren door te klikken op de Code > > uitvoeren regio > > alle uitvoeren op de werkbalk. Opmerking: Merk op dat de drie resulterende CSV-bestanden en een daaruit voortvloeiende txt-bestand ( figuur 1E) in de directory gedefinieerd in rij 19 verschijnen. Dit zijn: (I) de " data_all_conditions.csv " bestand bevat de verwerkte gegevens die overeenstemmen met elk experimentele conditie en experimentele replicaten, georganiseerd zoals beschreven in tabel 2. (II) de " statistieken summary.csv " bestand bevat een overzicht van de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van het percentage van vliegen op het platform voor elke voorwaarde die experimentele, het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD). (III) de " AUC.csv " bestand bevat het oppervlak onder de kromme voor elke experimentele repliceren. (IV) afhankelijk van het aantal voorwaarden aanwezig in de hoofdmap, zal het script een export een " Welch_t-test_results.txt " bestand (2 voorwaarden) of een " AUC_anova_results.txt " bestand (meer dan 2 voorwaarden), waar de resultaten van de t-toets of ANOVA vergelijken het oppervlak onder de kromme tussen experimentele omstandigheden worden aangegeven. Merk op dat vier verschillende soorten TIFF-afbeeldingsbestanden ( figuur 1E) in het pad gedefinieerd in rij 19 weergegeven. Deze heten: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (waarbij Name_Of_Data_Folder staat voor de naam van de map die de gebruiker), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " en " AUC_anova.tiff. " gedetailleerde informatie over de inhoud van deze grafieken kunnen worden gevonden in de resultaten van de vertegenwoordiger van dit manuscript en in Figuur 3.
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de“Drosophila eiland Assay” macro die kwantitatief Drosophila motor gedrag tijdens de bepaling van het eiland beoordeelt. De macro telt nauwkeurig de vliegen op het platform na verloop van tijd, waardoor het eiland assay zeer gevoelig en geschikt voor kwantitatieve evaluatie van de high-throughput van motorische defecten. De methodologie voorziet de vergelijking van enige voorwaarde, met vliegen gegroeid onder verschillende genetische en/of milieu-omstandigheden, met inbegrip van drug blootstelling. Deze uitlezing is dus vooral handig als ontdekkingshulpmiddel bij het uitvoeren van grote genetische of farmaceutische schermen, bij de studie van Drosophila modellen van bewegingsstoornissen en andere neurologische ziekten, of bij het onderzoek van motoriek of vlucht gedrag.
Het eiland assay protocol gepresenteerd in dit manuscript biedt voordelen ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden. Video-tracking motoriek is bijvoorbeeld veel meer tijd in beslag en minder geschikt voor het testen van grote steekproeven. De bepaling van het eiland is een high-throughput screening tool, en, in die zin is vergelijkbaar met de snelle interactieve negatieve geotaxis (RING) assay16. Het verschil tussen de twee is dat het eiland testen mogelijk maakt voor de detectie van een breder scala van motorische problemen; het onvermogen van vliegen om te vertrekken het platform kan worden veroorzaakt door gebreken in vlucht, springen, of wandelen gedrag veroorzaakt door vleugel (spier/neuronale) en/of been (spier/neuronale) gebreken. Aan de andere kant, beoordeelt de RING assay gebreken in beklimmen/wandelen gedrag veroorzaakt door gebreken van het been (spier/neuronale). In het geval dat gebruikers zijn geïnteresseerd in meerdere gedrags uitlezingen, kan de bepaling van het eiland ook gemakkelijk gecombineerd worden met andere testen, zoals de bepaling van de RING. Bovendien, lasers vereist voor optogenetics kunnen gemakkelijk geinstalleerd worden in het eiland assay vak, en de installatie is zo eenvoudig dat het gemakkelijk kan worden verplaatst naar een kamer waar temperatuur en licht kunnen worden gecontroleerd.
Om ervoor te zorgen het succes en de reproduceerbaarheid van de test van de eiland hier beschreven, moeten verscheidene aanbevelingen worden opgevolgd. Aliquot en overdracht de vliegen op de experimentele proef flesjes op ten minste één dag voor het experiment om de effecten van CO2 of koude anesthesie te voorkomen. Niet de experimentele flesjes doen overcrowd (gebruik 10-15 vliegen per flacon; het is het beste om altijd hetzelfde aantal vliegen per flacon). Houd de vliegen op vers voedsel te allen tijde. Als dit niet nog vertrouwd zijn met het uitvoeren van de bepaling, praktijk gooien vliegt op het platform te maximaliseren van het rendement. Ook de praktijk snel intrekken de hand vlak daarna, zoals het interfereert met de data-analyse (beeldanalyse en vlieg tellen start pas na de hand uit het beeld). Houden van de milieu- en experimentele voorwaarden identiek in experimenten die moeten worden vergeleken (bijvoorbeeld besturingselementen versus mutanten of een genotype getest op verschillende leeftijden). Altijd op hetzelfde moment van de dag uit te voeren van de experimenten en onderhouden van de flesjes onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheid. Test voor statistisch onderscheidingsvermogen, ten minste drie technische replicatieonderzoeken per biologische repliceren.
Voor het succesvol vervullen van de macro beschreven hier, webcam en beeld instellingen moeten worden aangepast om te bereiken maximale contrast: vliegt verschijnen als zwarte objecten op een wit platform. Wanneer het aantal vliegen is niet goed geteld door de macro, aanpassen van de instellingen voor contrast, Controleer of de ROI goed is geselecteerd, en ervoor zorgen dat de grootte van het vliegen op het platform boven het opgegeven minimum vliegen grootte instellen (zie stap 8.3 van dit protocol). De instellingen moeten slechts één keer worden gedefinieerd. Zij gelden voor alle experimenten, zo lang als de afstand tussen de webcam en het platform is niet veranderd. De Circularity_min en max instellingen definiëren de cirkelvormigheid van de deeltjes (deeltjes = getelde vliegen) dat zal worden in aanmerking genomen voor de analyse (vliegt = getelde objecten). 1 staat een perfecte cirkel, en 0 voor een lijn17. Aangezien de vliegen leggen altijd een zekere mate van cirkelvormigheid (een vlieg kan niet worden weergegeven als een rechte lijn), de “Circularity_max” is ingesteld op 1 en de “Circularity_min” is ingesteld op 0.4. Het is onwaarschijnlijk dat de gebruiker moet deze instellingen aanpassen.
De macro maakt af en toe tellen fouten wanneer een vlieg dicht bij de grens van het platform ligt. Dit kan gebeuren als de vliegen niet maar lopen in en uit de door de gebruiker gedefinieerde ROI vliegen. In de meeste gevallen kan u de ROI (montage zo veel mogelijk op het platform) gemakkelijk oplossen zulks uitvaardiging. Echter, het “Eiland Assay Analysis” script is kundig voor speurder en juiste onjuiste gegevens graven veroorzaakt door vliegen lopen in en uit de ROI relatief goed. Hoewel de resolutie van de webcam die hier gepresenteerd hoog genoeg om te vliegen in de nabijheid vrij goed te discrimineren is, hebben wij aanvullende algoritmen in de veredeling van de afbeelding van de“Drosophila eiland Assay” macro, zoals de waterscheiding en eroderen functie17. Dit vergemakkelijkt de juiste afbakening van vliegen die dicht op het platform zijn. Bovendien de macro kan onderscheid maken tussen vliegen die sprong van het platform of vloog weg. Het is echter over het algemeen waargenomen dat gezonde jonge vliegen stammen vliegen weg zodra neergezet op het platform, terwijl oudere vliegen en vliegen met motorische tekorten langer op het platform blijven en zal uiteindelijk springen of vallen van het platform. Ondanks deze beperkingen bieden de bepaling en analyse een zeer nauwkeurige maatstaf van locomotor gedrag.
Om ervoor te zorgen de succesvolle uitvoering van het script “Eiland Assay Analysis”, heeft de gebruiker om ervoor te zorgen om de juiste paden voor de input- en output-bestanden in de rijen van de script vermeld in het protocol en de gegevens te verstrekken in de juiste map-indeling (zoals aangegeven in Figuur 2). Als de gebruiker vindt de criteria gebruikt om te filteren op onbetrouwbare experimentele gegevens te streng (rij 68: de eerste waarde in de kolom “Count” is kleiner dan of gelijk aan 5; 71 rij: de eerste waarde in de kolom “Aantal” is hoger dan het totale aantal vliegen geworpen op de platfo RM + 3), zet deze filterinstellingen door toevoeging van een # vóór de tekst in de rijen 68 en 71 in het script van “Eiland Assay Analysis”. In dit geval zal alle datasets in de analyse worden meegenomen. U kunt ook kunnen filterinstellingen worden gewijzigd door de waarden in de rijen 68 en 71 volgens de behoeften van de gebruikers aan te passen. Mogelijke artefacten in de waarden in de “results.txt” gegenereerd door de“Drosophila eiland Assay” macro tellen kunnen ook handmatig worden aangepast, en het script opnieuw kan worden uitgevoerd op de gecorrigeerde gegevens. Wanneer de gebruiker is geïnteresseerd in het verwerken van meer dan 10 fps, of meer dan 10 s van gegevens, het aantal frames dat door het “Eiland Assay Analysis” script verwerkt moetworden aangepast. De statistische analyse kan ook worden vervangen door gebruiker gedefinieerde alternatieven.
Een map met de naam “Voorbeelden eiland Assay,” met voorbeelden met afbeelding-tijdreeksen verkregen met behulp van het eiland assay, kan worden gevonden op de volgende website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Download de folder “Voorbeelden eiland Assay” en volg de stappen die worden beschreven in dit protocol te snel vertrouwd worden gemaakt met de structuur van de opslag van het dossier, de verwerking van de beelden met de macro “Drosophila eiland assay” en de “eiland Assay analyse” script.
Het eiland assay, kan in combinatie met de ontwikkelde macro en analyse script, worden gebruikt voor het evalueren en kwantificeren van het gedrag van de abnormale beweging van een Drosophila model van ataxie Telangiectasia. Aangezien de bepaling kan efficiënt worden toegepast op verschillende leeftijden, is het zeer geschikt voor het analyseren van de mogelijk progressieve aard van fenotypen.
Kortom is het eiland assay, in combinatie met de macro“Drosophila eiland Assay” en het “Eiland Assay Analysis” script, een zeer efficiënte, kosteneffectieve en betrouwbare test voor objectief analyseren en kwantificeren van motorische defecten van Drosophila modellen van bewegingsstoornissen in zodanig hoge gegevensdoorvoer.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de Vienna Drosophila Resource Center en het Bloomington Drosophila voorraad center (NIH P40OD018537) voor het verstrekken van Drosophila stammen. We zijn dankbaar naar het Klämbt-laboratorium voor het introduceren van ons aan de bepaling van het eiland en Martijn Eidhof voor het bouwen van de eiland assay setup. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de E-zeldzame-3 gemeenschappelijke transnationale oproep verlenen “Voorbereiding van therapieën op autosomaal recessieve Ataxieën” voorbereiden (NWO 9003037604), door een TOP subsidie (912-12-109) van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO), en door twee DCN/Radboud University Medical Center PhD-beurzen. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | – |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | – | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | – | – | – |
| Lamp | – | – | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | – | – | Any mouse pad works |
| Island Assay box | – | – | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20×30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | – | – | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | – | – | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | – | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | – | – | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | – | – | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | – | – | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | – | – | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
Referências
- Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
- Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
- He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson’s disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
- Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
- Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
- Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
- Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).
- Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- . ImageJ User Guide – IJ 1.46 Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012)
