Análise do elevado-throughput de comportamento Locomotor no ensaio de ilha de Drosophila

No protocolo descrito, dados de ensaio de ilha de Drosophila são adquiridos e processados em três etapas. Em primeiro lugar, a resposta de fuga de voo de Drosophila lançada para a plataforma da ilha é gravada com uma webcam e armazenada como imagens individuais. bmp (seções de protocolo 1-7). Em segundo lugar, a macro”Drosophila ilha ensaio” (passo 8) processa os quadros, gerando um arquivo de texto “result” (tabela 1), em que o número de objetos detectados em cada quadro é resumido e uma pilha de imagem “Result_stack.tiff”, que mostra os objectos detectados dentro da área da plataforma em cada quadro. Em terceiro lugar, o roteiro de “Ilha do ensaio análise” (protocolo seção 9) processa os dados de macro armazenados nos arquivos de “Results” das experiências individuais. Vários passos são incorporados no script para filtrar e combinar os dados para a análise estatística. O primeiro quadro em que as moscas são lançadas na plataforma é detectado e considerado como o ponto do tempo 1. Quadros anteriores são eliminados do conjunto de dados. 100 frames seguindo tempo ponto 1 (correspondente a 10 s) são selecionados para análise. Experiências em que o número inicial de moscas detectado na plataforma é menor do que 5 são excluídas automaticamente a partir da análise, eliminando resultados não-confiáveis de experimentos de fraca potência. Experiências em que o número inicial de moscas detectado na plataforma excede a configuração de “Número de moscas por frasco”, mais uma tolerância de 3 são também excluídas. Isso elimina os conjuntos de dados no qual ruído partículas erroneamente foram detectadas como moscas. O script, em seguida, calcula a porcentagem de moscas detectado para cada ponto de tempo em comparação com o maior número de moscas detectado na série. Em conjuntos de dados causados por moscas andar dentro e fora do ROI (detectado como um decréscimo seguido por um aumento da percentagem de moscas na plataforma, ao longo do tempo) são automaticamente corrigidos os erros por considerando-os como consistentemente presente na plataforma em fases anteriores . Todos os conjuntos de dados replicar para uma determinada condição experimental que estavam presentes no diretório principal são combinados e exportados para o arquivo “data_all_conditions.csv”. Suas colunas representam as variáveis descritas na tabela 2. O script também irá exportar um gráfico de linha para cada condição experimental, nomeado de acordo com a pasta que contém os dados. Este gráfico mostra a porcentagem de moscas, permanecendo na plataforma, ao longo do tempo (resposta de fuga de voo) para o experimental Replica presente na pasta respectiva (Figura 3A-B). A média, SD e SEM para cada condição experimental são calculados e resumidas no arquivo “Summary.csv de estatísticas”. Um gráfico de linha, chamado “Escape_response_all_conditions.tiff” mostra a resposta de fuga de voo média para até 12 experimental condições presentes na pasta principal, a (Figura 3). Finalmente, a área sob a curva para todas as condições experimentais presentes na pasta principal é calculada e resumida no arquivo “AUC.csv”. Dependendo do número de condições presentes na pasta principal, o script irá realizar também um bicaudal pareado Welch-teste t (2 condições) ou uma ANOVA com correção de Tukey para vários testes (mais de 2 condições) determinar se o experimental condições diferem entre si significativamente. Esses resultados estão resumidos no “Welch_t-test_results.txt” ou “AUC_anova_results.txt.” Ao realizar a ANOVA, o script também irá exportar um arquivo de “AUC_anova.tiff” que exibe a diferença entre a média AUC e os intervalos de confiança de 95% das condições experimentais que são comparados. Os valores da área total sob a curva das repetições experimentais para todas as condições experimentais são exibidos como pontos de dados individuais com medianas em “AUC.tiff” (Figura 3D). Ataxia Telangiectasia (AT) é uma desordem autossômica recessiva movimento caracterizada por início precoce de ataxia cerebelar devido a mutações no gene Ataxia Telangiectasia mutado (ATM)14. Mutantes da Drosophila orthologue de ATM, tefu, exibem defeitos em mobilidade e longevidade15. Para avaliar a macro “Ensaio de ilha dedrosófila” , um modelo de Drosophila da AT foi testado no ensaio de ilha, e a saída de dados da macro foi comparado com a contagem manual de dados. Os resultados mostram que onipresente tefu nocaute (w–; Actin-Gal4/GD11950) diminui significativamente a capacidade dessas moscas para deixar a plataforma em comparação com seus controles de fundo genético (w–; Actin-Gal4/+) (Figura 4). Depois de 1 s, 50% das moscas controle tinha escapado da plataforma, em contraste com o < 1% de tefuRNAi – voa. Importante, os dados obtidos com a macro fielmente reproduzidos os dados obtidos pelo manual, contando, indicando que a macro é uma ferramenta confiável que pode ser usada para a quantificação dos dados de ensaio da ilha e a avaliação de defeitos do movimento ( Figura 4 A-B). Figura 1: fluxograma descrevendo os requisitos, procedimento experimental e análise do ensaio ilha. (A) ilha do ensaio o equipamento. (B) instalação Experimental para o ensaio da ilha. (C) ilha do ensaio. (D) processamento de dados de ensaio ilha com a macro”Drosophila ilha ensaio”. A macro”Drosophila ilha ensaio” é composta de 3 macros sub: 1) fazer a pilha e projeção, 2) definem plataforma e 3) a análise. (E) processamento e avaliação estatística de dados usando o script de “Análise do ensaio de ilha”. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: exemplos de diferentes ajustes necessários durante o protocolo de. (A) a necessária estrutura de diretórios em que ilha experimentos de ensaio devem ser armazenados para processamento de dados e análise. (B) ao ajustar as configurações de vídeo, devem aparecer moscas preto sobre um fundo branco. (C) quadro de imagem arquivos de saídacomo salvo pelo software de gravação de imagem descrito neste manuscrito. Estrutura de tópicos (D), o amarelo mostra a seleção de plataforma. A seleção de plataforma armazenado no “ROI Manager” é destacada em azul. (E) moscas são representadas como pontos brancos durante a adaptação do “mosca tamanho mínimo ajuste.” A janela de resultados mostra a área das moscas em pixels. (F) exemplo de uma moldura única imagem gravada (à esquerda) e o correspondente quadro na pilha de imagem resultante, obtido com a macro”Drosophila ilha ensaio” (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: imagens do resultado obtido após o processamento de dados com o roteiro de “Ilha do ensaio análise” (A) linha gráfico mostrando a resposta de fuga de voo para cada controle experimental replicar. (B) linha gráfico mostrando a resposta de fuga de voo para cada tefu RNAi experimental replicar. (C) resposta de fuga de voo médio indicadas condições experimentais; as barras de erro representam os lotes do SEM. (D) ponto que representa a área sob a distribuição da curva para controle e condições mutantes. Experimental é replicada para ambas as condições de RNAi e controle tefu é exibidas como pontos de dados individuais (em preto) com medianas (linha vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Onipresente tefu knockdown moscas mostram uma capacidade significativamente diminuída de deixar a plataforma. Os dados representam a porcentagem de moscas na plataforma ao longo do tempo (s) para o controle (w–; Actin-Gal4/+) e tefu RNAi (w–; Actin-Gal4/GD11950) voa. (número de repetições = 5; as barras de erro representam o SEM). (A) dados brutos obtidos com a macro”Drosophila ilha ensaio”. (B) ponto parcelas que representa a área sob a distribuição da curva para as condições de controle e tefu RNAi, obtidos com a macro”Drosophila ilha ensaio” (Welch não emparelhadas, teste-t * * p < 0,01). (C) dados brutos obtidos contando manualmente o número de moscas presentes na ilha por segundo. (D) ponto parcelas que representa a área sob a distribuição da curva para controle e Tefu RNAi condições obtidas por contagem manual (Welch não emparelhadas, teste-t * * p < 0,01). As barras de erro representam o SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Nome da coluna Descrição Fatia Nome do frame. Contagem O número de objetos detectados no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI). Área total Área total dos objetos detectados no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI) em pixels. Tamanho médio Área total dos objetos detectados no quadro dividido pelo número de objetos dentro dos limites da plataforma (ROI). % De área A porcentagem de área ocupada pelos objetos em relação a área total da plataforma (ROI). Perim. Perímetro total dos objetos detectados no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI) em pixels. Min. tamanho de voar O mínimo voar a configuração de tamanho definida pelo usuário na interface gráfica da macro”Drosophila ilha ensaio” (em pixels). Área de ROI A área da plataforma (ROI) definida pelo usuário durante a execução da macro sub definir plataforma (em pixels). Número de moscas O número de moscas usado por experimento definido pelo usuário na interface gráfica da macro”Drosophila ilha ensaio”. Tabela 1: Parâmetros medidos pela macro”Drosophila ilha ensaio”. Os parâmetros descritos na tabela aparecerá no arquivo “Results” ao executar a macro”Drosophila ilha ensaio”. Nome da coluna Descrição Fatia Número do quadro. Contagem O número de moscas detectado no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI). X.Area Área total das moscas detectado no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI) em pixels. Min. tamanho de voar O mínimo voar a configuração de entrada de tamanho definida pelo usuário na interface gráfica da macro”Drosophila ilha ensaio” (em pixels). Área de ROI A área da plataforma (ROI, em pixels) definida pelo usuário quando executar a macro sub “definir a plataforma”. Número de moscas O número de moscas usado por experimento definido pelo usuário na interface gráfica da macro”Drosophila ilha ensaio”. X.Count % voa presentes na plataforma no respectivo fatia/quadro relativo para o maior número de moscas detectado na plataforma durante o experimento. Commit Ponto do tempo 1 representa o primeiro quadro a ser analisado e corresponde ao quadro onde as moscas aparecem pela primeira vez na plataforma. Há um total de 100 frames por replicar analisados (correspondente a 10 s, quando usando as configurações descritas. Experimento Número de repetições por condição. Condição Indica o nome da condição experimental (de acordo com o nome definido pelo usuário da pasta que contém os dados). Tabela 2: Descrição das variáveis obtidas após o processamento dos dados com o roteiro de “Ilha do ensaio análise” Os parâmetros descritos nesta tabela aparecem no arquivo “data_all_conditions.csv” após o processamento dos dados com o roteiro de “Análise do ensaio de ilha”.