Itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l'espace extracellulaire du cerveau

L'espace extracellulaire (ECS) est le réseau de canaux interconnectés extérieurs à toutes les cellules du cerveau et contient à la fois le fluide interstitiel et la matrice extracellulaire ( Figure 1a et Figure 1b ). La distribution de nombreuses substances requises pour la fonction des cellules cérébrales, y compris les nutriments, les hormones et les neurotransmetteurs, se produit par diffusion à travers le système ECS. Les changements dans les paramètres physiques de cet espace, y compris le volume, la géométrie et la matrice extracellulaire, peuvent influer drastiquement sur la diffusion à travers l'ECS et les concentrations d'ions locales qui se baignent dans les cellules du cerveau, ce qui a un impact profond sur la fonction des cellules cérébrales ^{1 , 2} .

L'iontophorèse en temps réel (RTI) est utilisée pour déterminer deux caractéristiques structurelles d'une région du cerveau: fraction volumique et tortuosité ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. La fraction de volume ( α ) est la proportion de volume tissulaire occupée par ECS ( V _ECS ) par rapport au volume tissulaire total ( _tissu V ) dans un volume élémentaire représentatif;

La tortuosité ( λ ) est l'obstacle relatif qu'une substance rencontre lors de la diffusion dans une région du cerveau par rapport à un milieu sans obstruction;

Où D ^* (cm ² s ^-1 ) est le coefficient de diffusion efficace de la substance dans le cerveau et D (cm ² s ^-1 ) est le coefficient de diffusion libre de la substance dans un milieu libre, tel qu'un gel d'agarose dilué.

Aujourd'hui, la substance de sondes la plus utilisée pour le RLa méthode TI est le petit cation tétraméthylammonium (TMA). Le TMA a un poids moléculaire de 74 g / mol, se dissocie complètement en solution et a une charge positive. Les études de RTI avec cette ion ont démontré que α 0,2 et λ 1.6 ^{1 , 2} . Cela signifie que l'ECS représente environ 20% du volume total du cerveau et que la diffusion d'une petite molécule inerte est environ 2,5 fois plus lente dans l'ECS que dans un milieu sans obstruction ³ . Cependant, α et λ varient selon l'âge, la région et l'état du cerveau et dans les pathologies ¹ . Les modifications de ces paramètres ont été liées au développement du cerveau, au vieillissement, au sommeil, à l'épilepsie et à de nombreux autres processus et maladies fondamentales du cerveau ^{1, 6} . Alors que d'autres techniques mesurent α et λ , RTI peut mesurer à la fois dans les régions localisées du tissu vivant en temps réel. Pour cette raison, RTI est devenu un outil indispensable pour étudier les changements dans α et λ lors de défis aigus et réversibles.

La théorie de RTI a été initialement validée par Nicholson et Phillips, et la technique a été largement utilisée depuis cette époque ^{4 , 7} . Les expériences utilisant RTI commencent par la libération d'une impulsion de TMA à partir d'une microélectrode source par iontophorèse dans un gel dilué d'agarose. Une fois éjectés, les ions diffusent librement loin de la source ponctuelle, en choisissant d'un nombre potentiellement infini de chemins aléatoires ( figure 1d ). La concentration changeante de l'ion est mesurée au fil du temps à l'aide d'une microélectrode sélective d'ions (ISM) positionnée à peu près100 μm loin ( Figure 1c ). Les changements dans la concentration de TMA sont représentés graphiquement et ajustés à une courbe qui permet le calcul de D et du nombre de transport de la microélectrode d'iontophorèse (paramètres discutés dans le protocole). Avec ces valeurs, la procédure est répétée dans une région du cerveau d'intérêt pour obtenir D ^* et pour calculer α et λ . Le contrôle de la microélectrode d'iontophorèse, la collecte de données, la représentation graphique et l'ajustement de la courbe de concentration de TMA et le calcul des paramètres expérimentaux sont généralement réalisés par les programmes Wanda et Walter, spécialement conçus à cet effet (le logiciel et leurs manuels sont Librement disponible auprès des auteurs sur demande).

La section Protocole de cette revue décrit les procédures de base nécessaires à la conception et à l'exécution de RTI dans les tranches de cerveau de rongeurs. La technique a également été utilisée en non-tigemodèles ent, notamment des tranches de cerveau humain et de vivo des préparations de cerveau ^{1, 4, 6, 8, 9.} La section Résultats représentatifs fournit des résultats idéaux et non idéaux pour mettre en évidence les nuances de l'interprétation des données. Enfin, la section de discussion couvre brièvement les techniques de dépannage, les limitations de RTI, les techniques alternatives utilisées pour étudier l'ECS et les applications futures de RTI.

Figure 1: Diagrammes de diffusion à travers ECS. (A) Schéma d'ECS: Démontre la taille et l' emplacement de l'ECS dans une section typique du cerveau. Yellow marque le ECS entre les processus des cellules du cerveau gris. Le volume de l'ECS est d'environ 20% du volume tissulaire total ( c.-à-d., Fraction de volume = 0.2) dans des conditions physiologiques. ( B ) Diagramme agrandi de l'ECS: met en évidence des paramètres physiques contribuant à la tortuosité, y compris la géométrie des cellules du cerveau (gris) et la matrice extracellulaire (diagrammes sous forme de maille de glycosaminoglycanes multicolores et de protéoglycans). ( C ) diagramme 3D de diffusion à partir d'une source ponctuelle: démontre le mouvement net des molécules inertes d'une source iontophorétique à un ISM. À l'exclusion des barrières de diffusion et de l'absorption cellulaire, les molécules diffusent vers l'extérieur dans toutes les directions, produisant un front de concentration sphérique. L'ISM quantifie la concentration locale des molécules inertes libérées par la source iontophorétique. ( D ) Simulation par ordinateur de la diffusion dans ECS du cerveau: [Extrême gauche] Configuration pour la simulation de Monte Carlo; Les sphères vertes représentent les processus des cellules du cerveau et la croix rouge représente une source ponctuelle. Cette configuration modélise le tissu cérébral diagramme de la figure 1a . [Images du milieu] 3 et6 molécules effectuant des mouvements aléatoires lorsqu'elles se diffusent à travers l'espace extracellulaire du cerveau, montrées en 2 dimensions. [Extrême droite] Des randonnées aléatoires de nombreuses molécules sorties de la source ponctuelle. Le mouvement net de toutes les molécules de la source ponctuelle est vers l'extérieur comme représenté sur la figure 1c . Les randonnées aléatoires cumulatives décrivent les espaces entre les cellules ( c.-à -d. ECS, voir la référence ⁵ pour plus d'explications). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.