Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

Der extrazelluläre Raum (ECS) ist das Netzwerk von miteinander verbundenen Kanälen außerhalb aller Gehirnzellen und enthält sowohl interstitielle Flüssigkeit als auch extrazelluläre Matrix ( Abbildung 1a und Abbildung 1b ). Die Verteilung von vielen Substanzen, die für die Gehirnzellfunktion erforderlich sind, einschließlich Nährstoffe, Hormone und Neurotransmitter, erfolgt durch Diffusion durch die ECS. Änderungen der physikalischen Parameter dieses Raumes, einschließlich Volumen, Geometrie und extrazelluläre Matrix, können die Diffusion durch die ECS und die lokalen Ionenkonzentrationen, die Gehirnzellen, die einen tiefen Einfluss auf die Gehirnzellfunktion ^{1 , 2} haben, drastisch beeinflussen.

Die Echtzeit-Iontophorese (RTI) dient zur Bestimmung von zwei strukturellen Merkmalen einer Hirnregion: Volumenanteil und Tortuosität ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5 Der Volumenanteil ( α ) ist der Anteil des von der ECS ( V _ECS ) besetzten Gewebevolumens bezogen auf das gesamte Gewebevolumen ( V- _Gewebe ) in einem repräsentativen Elementarvolumen;

Tortuosität ( λ ) ist die relative Hinderung, dass eine Substanz beim Diffundieren durch eine Hirnregion im Vergleich zu einem Medium ohne Hindernisse begegnet;

Wobei D ^* (cm ² s ^-1 ) der effektive Diffusionskoeffizient der Substanz im Gehirn ist und D (cm ² s ^-1 ) der freie Diffusionskoeffizient der Substanz in einem freien Medium, wie verdünntes Agarosegel, ist.

Heute ist die am häufigsten verwendete Sondensubstanz für die RTI-Methode ist das kleine Kation Tetramethylammonium (TMA). TMA hat ein Molekulargewicht von 74 g / mol, vollständig dissoziiert in Lösung und hat eine positive Ladung. RTI-Studien mit diesem Ion haben gezeigt, dass α 0,2 und λ 1,6 ^{1 , 2} . Das bedeutet, dass die ECS etwa 20% des gesamten Hirnvolumens beträgt und dass die Diffusion eines kleinen, inerten Moleküls im ECS etwa 2,5 mal langsamer ist als in einem Medium ohne Hindernisse ³ . Jedoch variieren sowohl α als auch λ mit Hirnalter, Region und Zustand und in pathologischen Zuständen ¹ . Veränderungen dieser Parameter wurden mit der Entwicklung des Gehirns, Alterung, Schlaf, Epilepsie und vielen anderen grundlegenden Prozessen und Erkrankungen des Gehirns verbunden ^{1, 6} Während andere Techniken α und λ messen, kann RTI sowohl in lokalisierten Regionen des lebenden Gewebes in Echtzeit messen. Aus diesem Grund ist RTI zu einem unverzichtbaren Werkzeug geworden, um Veränderungen in α und λ bei akuten und reversiblen Herausforderungen zu untersuchen.

Die Theorie, die RTI unterstützt, wurde ursprünglich von Nicholson und Phillips validiert, und die Technik wurde seit dieser Zeit ^{4 , 7} ausführlich verwendet. Experimente, die RTI einsetzen, beginnen mit der Freisetzung eines Pulses von TMA aus einer Quellenmikroelektrode durch Iontophorese in ein verdünntes Agarosegel. Einmal ausgestoßen, diffundieren die Ionen frei von der Punktquelle und wählen aus einer potentiell unendlichen Anzahl von zufälligen Pfaden ( Abbildung 1d ). Die sich ändernde Konzentration des Ions wird über die Zeit unter Verwendung einer ionenselektiven Mikroelektrode (ISM) gemessen, die grob positioniert ist100 μm entfernt ( Abbildung 1c ). Die Änderungen der TMA-Konzentration werden aufgezeichnet und an eine Kurve angepasst, die die Berechnung von D und der Transportnummer der Iontophorese-Mikroelektrode erlaubt (Parameter, die im Protokoll diskutiert werden). Mit diesen Werten wird die Prozedur in einem interessierenden Hirnbereich wiederholt, um D ^* zu erhalten und sowohl α als auch λ zu berechnen. Die Steuerung der Iontophorese-Mikroelektrode, die Datenerfassung, die graphische Darstellung und die Anpassung der TMA-Konzentrationskurve und die Berechnung der experimentellen Parameter erfolgt in der Regel durch die Programme Wanda und Walter, die speziell für diesen Zweck konzipiert wurden (die Software und ihre Handbücher sind Frei von den Autoren auf Anfrage erhältlich).

Der Abschnitt "Protokoll" dieser Überprüfung beschreibt die grundlegenden Verfahren, die für die Konstruktion und Durchführung von RTI in Nagetierhirnscheiben erforderlich sind. Die Technik wurde auch in Nicht-Stab verwendetModelle, einschließlich menschliche Gehirnscheiben und de vivo Gehirnpräparate ^{1 , 4 , 6 , 8 , 9} . Der Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" bietet sowohl ideale als auch nicht ideale Ergebnisse, um Nuancen bei der Dateninterpretation hervorzuheben. Schließlich behandelt der Diskussionsteil kurz die Techniken zur Fehlerbehebung, die Beschränkungen von RTI, alternative Techniken, die zum Studium der ECS und zukünftige Anwendungen von RTI verwendet werden.

Abbildung 1: Diagramme der Diffusion durch ECS. ( A ) Diagramm der ECS: Zeigt die Größe und den Standort des ECS in einem typischen Gehirnteil an. Gelb markiert das ECS zwischen den grauen Gehirnzellenprozessen. Das Volumen des ECS beträgt etwa 20% des gesamten Gewebevolumens ( dh der Volumenanteil = 0.2) unter physiologischen Bedingungen. ( B ) Vergrößertes Diagramm des ECS: Highlights der physikalischen Parameter, die zur Tortuosität beitragen, einschließlich der Gehirnzellgeometrie (grau) und der extrazellulären Matrix (als Mesh von mehrfarbigen Glycosaminoglykanen und Proteoglykanen dargestellt). ( C ) 3D-Diagramm der Diffusion von einer Punktquelle: Demonstriert die Nettobewegung von inerten Molekülen von einer iontophoretischen Quelle zu einem ISM. Ohne Diffusionsbarrieren und zelluläre Aufnahme diffundieren Moleküle in alle Richtungen nach außen und erzeugen eine kugelförmige Konzentrationsfront. Das ISM quantifiziert die lokale Konzentration der aus der iontophoretischen Quelle freigesetzten inerten Moleküle. ( D ) Computersimulation der Diffusion in ECS des Gehirns: [Far left] Setup für Monte Carlo Simulation; Grüne Sphären stellen Gehirnzellenprozesse dar und das rote Kreuz stellt eine Punktquelle dar. Dieses Setup modelliert das in Abbildung 1a dargestellte Hirngewebe. [Mittlere Bilder] 3 und6 Moleküle, die zufällige Bewegungen durchführen, während sie durch den extrazellulären Raum des Gehirns diffundieren, in 2 Dimensionen gezeigt. [Weit rechts] Zufällige Spaziergänge von vielen Molekülen, die von der Punktquelle freigesetzt werden. Die Netzbewegung aller Moleküle von der Punktquelle ist nach außen, wie in Fig. 1c dargestellt, nach außen. Die kumulativen Zufallswege skizzieren die Räume zwischen den Zellen ( dh die ECS, siehe Referenz ⁵ für weitere Erläuterungen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.