使用染色质免疫沉淀分析c-KIT配体启动子
Summary
DNA-蛋白质的相互作用对多种生物过程至关重要。在评估细胞功能时，DNA-蛋白质相互作用的分析对于了解基因调控是必不可少的。染色质免疫沉淀（ChIP）是分析体内这种相互作用的有力工具。
Abstract
多重细胞过程，包括DNA复制和修复，DNA重组和基因表达，需要蛋白质和DNA之间的相互作用。因此，DNA-蛋白相互作用调节多种生理，病理生理和生物功能，如细胞分化，细胞增殖，细胞周期控制，染色体稳定性，表观遗传基因调控和细胞转化。在真核细胞中，DNA与组蛋白和非组蛋白蛋白相互作用，并被浓缩成染色质。可以使用几种技术工具来分析DNA-蛋白质相互作用，例如电泳（凝胶）移动性测定（EMSA）和DNA酶I足迹。然而，这些技术在体外分析蛋白质 – DNA相互作用，而不是在细胞环境中。染色质免疫沉淀（ChIP）是一种在其特定DNA结合位点捕获蛋白质的技术，从而允许鉴定DNA-蛋白质相互作用在染色质环境中。通过固定DNA-蛋白质相互作用，然后免疫沉淀所关注的蛋白质来完成。随后，表征蛋白质结合的基因组位点。在这里，我们描述和讨论ChIP并证明其分析价值，用于鉴定转录生长因子-β（TGF-β）诱导的转录因子SMAD2与酪氨酸 – 酪氨酸激酶启动子区域中SMAD结合元件（SBE）的结合，蛋白激酶试剂盒（c-KIT）受体配体干细胞因子（SCF）。
Introduction
在真核生物核中，DNA与组蛋白和非组蛋白相互作用，并被凝聚成染色质。在生理，病理生理和细胞生物学环境中，细胞功能在空间上暂时受染色质协调基因表达控制。 DNA-蛋白质相互作用在细胞过程的调节中起重要作用，如DNA复制，重组和修复以及蛋白质表达。因此，DNA-蛋白质相互作用的分析是评估基因表达和细胞功能不可缺少的工具。
存在几种用于评估体外 DNA-蛋白质相互作用的技术 ，例如电泳（凝胶）移动性测定（EMSA）和DNA酶I印迹1,2 。然而，这些技术不分析染色质和细胞环境中的蛋白质 – DNA相互作用。 ChIP我sa技术捕获与其特异性DNA结合位点结合的蛋白质，从而有助于鉴定染色质环境中的DNA-蛋白质相互作用。该技术最初由Gimour和Lis开发，用于评估RNA聚合酶II与大肠杆菌和果蝇中的特异性基因的结合3,4 。通过固定DNA-蛋白复合物，然后进行染色质提取并将DNA剪切到约200个碱基对（bp）片段中。随后，通过免疫沉淀分离感兴趣的DNA结合蛋白。在DNA-蛋白质交联反转后，纯化和分析DNA。可以使用几种方法来分析蛋白质结合位点，并且取决于靶基因5内的蛋白质结合位点的核酸序列。在DNA序列已知的情况下，标准Pol可以使用侧翼于已知结合位点的特异性引物对应用ymerase链反应（PCR）。定量实时PCR（qRT-PCR）也可以使用6 。在序列未知的情况下，ChIP可以与DNA微阵列（片上芯片），DNA测序（ChIP-seq）或克隆技术7,8,9组合 。
TGF-β途径具有很强的肿瘤抑制功能，是细胞分化的关键途径。它通过TGF-β1配体与其同源受体复合物的结合而被激活，导致SMAD2 / 3转录因子的丝氨酸磷酸化。在与常见介体SMAD4结合后，SMAD复合物转移到细胞核并与靶基因启动子区域内的SBE结合，其中它调控控制细胞周期，细胞凋亡和细胞分化的基因上。 TGF-β刺激的转录反应是细胞类型和上下文特异性10 。最近，我们描述了TGF-β和c-KIT途径之间的正反馈回路11 。在该模型中，TGF-β1激活的SMAD2结合c-KIT配体启动子并诱导其表达和分泌。随后，c-KIT配体以自动和对位方式激活c-KIT受体。 c-KIT受体活化通过JAK1 / 2导致STAT3 Tyr 705-磷酸化。 STAT3激活和核易位后，STAT3结合TGF-β1配体基因并调节其表达。
在这里，我们证明ChIP分析对于识别SMAD2与c-KIT受体配体启动子的结合以及鉴定信号转导子（和）转录3（STAT3与TGF-β1-基因）。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本报告中，我们证明了TGF-β1诱导的SMAD2与c-KIT配体启动子内的SBE和TGF-β1诱导的STAT3与TGF-β1配体基因内识别序列的结合的结合。我们使用染色质免疫沉淀显示细胞因子诱导的两种转录因子的结合。
染色质免疫沉淀是一个有力的工具，用于证明目标蛋白与DNA的直接结合，以表征诱导蛋白质与DNA结合的刺激物，并表征蛋白质结合的DNA序列。后一信息可以帮助鉴定由特定目的蛋白?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到德克萨斯大学MD安德森癌症中心，德克萨斯州休斯顿（启动基金会BB）的支持。
Materials
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
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