DNA-protein etkileşimleri, çoklu biyolojik işlemler için gereklidir. Hücresel işlevlerin değerlendirilmesi sırasında, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen düzenlemesinin anlaşılması için vazgeçilmezdir. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), böyle etkileşimleri in vivo olarak analiz etmek için güçlü bir araçtır .
DNA replikasyonu ve onarımı, DNA rekombinasyonu ve gen ekspresyonu dahil olmak üzere çoklu hücresel süreçler, proteinler ve DNA arasında etkileşim gerektirir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimleri, hücre farklılaşması, hücre proliferasyonu, hücre döngüsü kontrolü, kromozom stabilitesi, epigenetik gen düzenlenmesi ve hücre dönüşümü gibi çoklu fizyolojik, patofizyolojik ve biyolojik fonksiyonları düzenler. Ökaryotik hücrelerde DNA, histon ve histokonsuz proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Deneyi (EMSA) ve DNase I ayak izi gibi DNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için çeşitli teknik araçlar kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler protein-DNA etkileşimini in vitro olarak analiz eder, hücresel bağlam içinde değil. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), proteinleri belirli DNA bağlama bölgelerinde yakalayan ve böylece DNA-protein etkileşimini tanımlayan bir tekniktirOnların kromatin bağlamı içinde. DNA-protein etkileşiminin sabitlenmesiyle, ardından ilgilenilen proteinin immüno çökmesi ile yapılır. Daha sonra, proteinin bağlı olduğu genomik bölge karakterize edilir. Burada, ÇIP'yi tarif eder ve tartışır ve transkripsiyon faktörü SMAD2'nin Transforma Edici Büyüme Faktörü-β (TGF-β) ile indüklenmiş SMAD2'nin tirozin-bağışıklık sisteminin promotör bölgesi içindeki SMAD Bağlama Elemanları'na (SBE) bağlanmasının tanımlanması için analitik değerini gösteririz Protein kinaz Kiti (c-KIT) reseptör ligandı Kök Hücre Faktörü (SCF).
Ökaryotların çekirdeğinde DNA, histon proteinleri ve histolojik olmayan proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Fizyolojik, patofizyolojik ve hücre biyolojik bağlamında, hücresel fonksiyonlar mekansal olarak ve geçici olarak kromatin koordine edilmiş gen ifadesi ile kontrol edilir. DNA-protein etkileşimleri, DNA replikasyonu, rekombinasyon ve tamir gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesinde ve protein ekspresyonunda önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen ekspresyonunun ve hücre fonksiyonunun değerlendirilmesinde vazgeçilmez bir araçtır.
Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA) ve DNase I ayak izi 1 , 2 gibi in vitro DNA-protein etkileşimlerini değerlendirmek için çeşitli teknikler mevcuttur. Bununla birlikte, bu teknikler, kromatin ve hücresel bağlamda protein-DNA etkileşimini analiz etmez. ChIP iSa tekniği, spesifik DNA bağlama alanlarına bağlı proteinleri yakalar ve böylece kromatin bağlamında DNA-protein etkileşimlerinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu teknik esas olarak Gimour ve Lis tarafından, Escherichia coli ve Drosophila melanogaster 3 , 4'te spesifik genlere RNA polimeraz II'nin bağlanmasının değerlendirilmesi için geliştirildi. DNA-protein komplekslerinin sabitlenmesiyle, bunu takiben kromatin ekstraksiyonu yapılarak DNA'nın ~ 200 baz çifti (bp) parçalara kesilmesi ile yapılır. Daha sonra, ilgili DNA'ya bağlı protein immüno çökeltme ile izole edilir. DNA-protein çapraz bağlantının tersine çevrilmesinden sonra, DNA arıtılır ve analiz edilir. Protein bağlama bölgelerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve hedef gen 5 içindeki protein bağlama alanının nükleik asit dizisine bağlıdır. DNA dizisinin bilinmesi durumunda, standart PolYmeraz Zincir Reaksiyonları (PCR), bilinen bağlama alanına bitişik spesifik primer çiftleri kullanılarak uygulanabilir. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) de kullanılabilir 6 . Dizinin bilinmediği durumlarda, ChIP, DNA mikrodizileri (ChIP-on-chip), DNA dizilimi (ChIP-seq) veya klonlama teknikleri 7 , 8 , 9 ile birleştirilebilir .
TGF-β yolu güçlü tümör baskılayıcı işlevlere sahiptir ve hücre farklılaşmasında önemli bir yol oluşturmaktadır. TGF-β1 ligandının kognat reseptör kompleksine bağlanması yoluyla aktive edilir ve SMAD2 / 3 transkripsiyon faktörlerinin serin fosforilasyonuna neden olur. Ortak mediyatör olan SMAD4 ile olan ilişkisini takiben, SMAD kompleksi çekirdeğe translokasyon yapar ve hedef genlerin promotörü bölgesi içinde SBE'ye bağlanır ve burada hücre döngüsü, apoptoz ve hücre farklılaşmasını kontrol eden genleri düzenlerüzerinde. TGF-β stimülasyonuna transkripsiyonel yanıt hücre tipi ve bağlam-spesifik 10'dur . Son zamanlarda, TGF-β ve c-KIT yolu arasında olumlu bir geri besleme döngüsü tanımladık 11 . Bu modelde, TGF-β1 ile aktive olan SMAD2, c-KIT ligand yükselticisine bağlanır ve ekspresyonunu ve sekresyonunu indükler. Daha sonra, c-KIT ligandı, c-KIT reseptörünü otomatik ve para-kreynik biçimde aktive eder. C-KIT reseptör aktivasyonu, JAK1 / 2 yoluyla STAT3 Tyr 705 fosforilasyonuna neden olur. STAT3-aktivasyonu ve nükleer translokasyonu takiben STAT3, TGF-β1 ligand genine bağlanır ve ekspresyonunu düzenler.
Burada SMAD2'nin c-KIT reseptör ligand yükselticisine bağlanması ve Sinyal Transdüseri (ve) Aktivatörün (Transkripsiyon 3) (STAT3'in TGF-β1'e bağlanması) tanımlanması için ChIP analizinin temel rolünü gösteriyoruz gen).
Bu raporda SMAD2'nin c-KIT ligand yükselticisindeki bir SBE'ye TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını ve STAT3'ün TGF-β1 ligand geni içindeki tanıma dizisine TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz. Kromatin immüno çökeltme yöntemini kullanarak her iki transkripsiyon faktörünün sitokinle indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz.
Kromatin immüno çökeltme, bir proteinin DNA'ya doğrudan bağlanmasını, protein ile DNA'nın bağlanmasını sa?…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Texas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi, Houston, TX (başlangıç fonları, BB) tarafından desteklenmiştir.
HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |