Analys av c-KIT-ligand-promotorn med användning av kromatinimmunfällning
Summary
DNA-protein interaktioner är väsentliga för flera biologiska processer. Under utvärderingen av cellulära funktioner är analysen av DNA-protein interaktioner oumbärlig för att förstå genreglering. Kromatinimmunutfällning (ChIP) är ett kraftfullt verktyg för att analysera sådana interaktioner in vivo.
Abstract
Multipla cellulära processer, inklusive DNA-replikation och reparation, DNA-rekombination och genuttryck, kräver interaktioner mellan proteiner och DNA. Därför reglerar DNA-proteininteraktioner multipla fysiologiska, patofysiologiska och biologiska funktioner, såsom celldifferentiering, cellproliferation, cellcykelstyrning, kromosomstabilitet, epigenetisk genreglering och celltransformation. I eukaryota celler interagerar DNA med histon- och nonhistonproteiner och kondenseras till kromatin. Flera tekniska verktyg kan användas för att analysera DNA-proteininteraktioner, såsom elektrofotografi (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) och DNase I-fotavtryck. Dessa tekniker analyserar emellertid protein-DNA-interaktionen in vitro , inte inom det cellulära sammanhanget. Kromatinimmunutfällning (ChIP) är en teknik som fångar proteiner vid deras specifika DNA-bindningsställen, vilket möjliggör identifiering av DNA-proteininteraktionS inom deras kromatinkontext. Det görs genom fixering av DNA-proteininteraktionen, följt av immunutfällning av proteinet av intresse. Därefter karakteriserades den genomiska platsen som proteinet var bunden till. Här beskriver och diskuterar vi ChIP och demonstrerar dess analytiska värde för identifieringen av transformerande tillväxtfaktor-p (TGF-p) -inducerad bindning av transkriptionsfaktorn SMAD2 till SMAD-bindande element (SBE) inom promotorområdet hos tyrosin- Proteinkinas (c-KIT) -receptorligandstamcellsfaktor (SCF).
Introduction
I kärnan av eukaryoter interagerar DNA med histonproteiner och nonhistonproteiner och kondenseras till kromatin. I det fysiologiska, patofysiologiska och cellbiologiska sammanhanget kontrolleras cellfunktionerna rumligt och temporärt av kromatinkoordinerat genuttryck. DNA-protein-interaktioner har en väsentlig roll vid reglering av cellulära processer, såsom DNA-replikation, rekombination och reparation, såväl som proteinuttryck. Därför är analysen av DNA-protein-interaktioner ett oumbärligt verktyg vid utvärderingen av genuttryck och cellfunktion.
Flera tekniker existerar för att bedöma DNA-protein-interaktioner in vitro , såsom elektrofiles (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) och DNase I fotavtryck 1 , 2 . Emellertid analyserar dessa tekniker inte protein-DNA-interaktionen inom kromatin och cellulärt sammanhang. ChIP iEn teknik som fångar proteiner bundna till deras specifika DNA-bindningsställen och därmed underlättar identifieringen av DNA-protein-interaktioner inom kromatinkontexten. Tekniken var ursprungligen utvecklad av Gimour och Lis för bedömningen av RNA-polymeras II-bindning till specifika gener i Escherichia coli och Drosophila melanogaster 3 , 4 . Det görs genom fixering av DNA-proteinkomplexen, följt av utmatning av kromatin och skjuvning av DNA i ~ 200 baspar (bp) -fragment. Därefter isoleras det DNA-bundna proteinet av intresse genom immunutfällning. Efter reversering av DNA-proteintvärbindningen renas och analyseras DNA. Flera metoder kan användas för analys av proteinbindningsställena och beror på nukleinsyrasekvensen hos proteinbindningsstället inom målgenen 5 . I fall där DNA-sekvensen är känd, standardpolYmeras kedjereaktioner (PCR) kan appliceras, med användning av specifika primerpar som flankerar det kända bindningsstället. Kvantitativ realtid PCR (qRT-PCR) kan också användas 6 . I fall där sekvensen är okänd kan ChIP kombineras med DNA-mikroarrays (ChIP-on-chip), DNA-sekvensering (ChIP-seq) eller kloningsteknik 7 , 8 , 9 .
TGF-P-vägen har kraftiga tumörundertryckande funktioner och är en nyckelväg i celldifferentiering. Det aktiveras genom bindning av TGF-P1-liganden till dess kognitiva receptorkomplex, vilket resulterar i serin-fosforylering av SMAD2 / 3-transkriptionsfaktorer. Efter deras förening med den gemensamma mediatorn, SMAD4, translaterar SMAD-komplexet till kärnan och binder till SBE inom promotorregionen hos målgenerna, där det reglerar gener som kontrollerar cellcykeln, apoptos och celldifferentieringenpå. Det transkriptionella svaret på TGF-p-stimulering är celltyp- och kontextspecifik 10 . Nyligen har vi beskrivit en positiv återkopplingsslinga mellan TGF-p och c-KIT-vägen 11 . I denna modell binder TGF-p1-aktiverad SMAD2 till c-KIT ligandpromotorn och inducerar dess uttryck och utsöndring. Därefter aktiverar c-KIT-liganden c-KIT-receptorn på ett auto-och para-kriniskt sätt. C-KIT-receptoraktivering resulterar i STAT3 Tyr 705- fosforylering via JAKl / 2. Efter STAT3-aktivering och nukleär translokation binds STAT3 till TGF-P1 ligandgenen och reglerar dess uttryck.
Här demonstrerar vi den väsentliga rollen av ChIP-analys för identifiering av SMAD2-bindning till c-KIT-receptorligandpromotorn och för identifiering av signaltransducer (och) aktivator (av) transkription 3 (STAT3-bindning till TGF-P1- gen).
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna rapport demonstrerar vi den TGF-β1-inducerade bindningen av SMAD2 till en SBE inom c-KIT ligandpromotorn och TGF-P1-inducerad bindning av STAT3 till dess igenkänningssekvens inom TGF-P1-ligandgenen. Vi demonstrerar cytokininducerad bindning av båda transkriptionsfaktorerna genom användning av kromatinimmunutfällning.
Kromatinimmunutfällning är ett kraftfullt verktyg för att demonstrera direkt bindning av ett protein av intresse för DNA, för att karakterisera stimuli som ind…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (startfonder, BB).
Materials
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
Referências
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26 (1), 37-47 (2002).
- Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).
- Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).
- Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94 (5), 585-594 (1998).
- Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).
- Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).
- Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).
