Анализ промотора c-KIT-лиганда с использованием иммунопреципитации хроматина
Summary
Взаимодействия ДНК-белок необходимы для нескольких биологических процессов. Во время оценки клеточных функций анализ взаимодействия ДНК-белка является необходимым для понимания регуляции генов. Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) является мощным инструментом для анализа таких взаимодействий in vivo.
Abstract
Множественные клеточные процессы, включая репликацию и восстановление ДНК, рекомбинацию ДНК и экспрессию генов, требуют взаимодействия между белками и ДНК. Поэтому взаимодействия ДНК-белок регулируют многочисленные физиологические, патофизиологические и биологические функции, такие как клеточная дифференциация, клеточная пролиферация, контроль клеточного цикла, стабильность хромосом, регуляция эпигенетического гена и трансформация клеток. В эукариотических клетках ДНК взаимодействует с белками гистонов и негистонов и конденсируется в хроматин. Для анализа взаимодействия ДНК-белок можно использовать несколько технических средств, таких как анализ сдвига подвижности электрофореза (гель) (EMSA) и отпечаток ДНКазы I. Однако эти методы анализируют взаимодействие белка и ДНК in vitro , а не внутри клеточного контекста. Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) представляет собой метод, который захватывает белки в их специфических сайтах связывания ДНК, тем самым позволяя идентифицировать взаимодействие ДНК-белкаS в контексте их хроматина. Это делается путем фиксации взаимодействия ДНК-белка с последующей иммунопреципитацией представляющего интерес белка. Впоследствии характерен геномный сайт, связанный с белком. Здесь мы описываем и обсуждаем ChIP и демонстрируем его аналитическое значение для идентификации индуцированного Трансформирующим фактором роста фактора β-β (TGF-β) фактора транскрипции SMAD2 в SMAD-связывающие элементы (SBE) в промоторной области тирозин- Белковая киназа Kit (c-KIT) рецепторный лиганд фактор стволовых клеток (SCF).
Introduction
В ядре эукариот ДНК взаимодействует с белками гистонов и белками негистона и конденсируется в хроматин. В физиологическом, патофизиологическом и клеточном биологическом контексте клеточные функции пространственно и временно контролируются с помощью согласованной с хроматином генной экспрессии. ДНК-белковые взаимодействия играют существенную роль в регуляции клеточных процессов, таких как репликация ДНК, рекомбинация и восстановление, а также экспрессия белка. Поэтому анализ взаимодействия ДНК-белок является незаменимым инструментом в оценке экспрессии генов и функции клеток.
Существует несколько методов для оценки взаимодействия ДНК-белка in vitro , такого как анализ сдвига подвижности электрофореза (гель) (EMSA) и отпечаток 1 , 2 ДНКазы I. Однако эти методы не анализируют взаимодействие белка и ДНК в хроматинном и клеточном контексте. ChIP iКоторая захватывает белки, связанные с их специфическими сайтами связывания ДНК, и тем самым облегчает идентификацию взаимодействий ДНК-белок в контексте хроматина. Метод был первоначально разработан Gimour и Lis для оценки связывания РНК-полимеразы II с определенными генами в Escherichia coli и Drosophila melanogaster 3 , 4 . Это делается путем фиксации ДНК-белковых комплексов с последующим проведением экстракции хроматина и срезанием ДНК в фрагменты пар 200 пар (bp). Впоследствии связанный ДНК-связывающий белок выделяют иммунопреципитацией. После разворота сшивки ДНК-белка ДНК очищают и анализируют. Для анализа сайтов связывания белка могут быть использованы несколько методов и зависят от последовательности нуклеиновой кислоты сайта связывания белка в гена-мишени 5 . В случаях, когда последовательность ДНК известна, стандартный PolYermase Chain Reactions (PCR) можно применять, используя определенные пары праймеров, фланкирующие известный сайт связывания. Также можно использовать количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) 6 . В случаях, когда последовательность неизвестна, ChIP можно комбинировать с микрочипами ДНК (ChIP-on-chip), секвенированием ДНК (ChIP-seq) или методами клонирования 7 , 8 , 9 .
Путь TGF-β обладает мощными функциями подавления опухолей и является ключевым путем дифференциации клеток. Он активируется посредством связывания лиганда TGF-β1 с его рецепторным комплексом, что приводит к серинфосфорилированию SMAD2 / 3 транскрипционных факторов. После их ассоциации с общим медиатором SMAD4 SMAD-комплекс транслоцирует ядро и связывается с SBE в промоторной области генов-мишеней, где он регулирует гены, контролирующие клеточный цикл, апоптоз и клеточный дифференциална. Транскрипционный ответ на стимуляцию TGF-β является клеточным типом и контекстом 10 . Недавно мы описали цикл положительной обратной связи между TGF-β и c-KIT-каналом 11 . В этой модели активированный TGF-β1 SMAD2 связывается с промотором лиганда c-KIT и индуцирует его экспрессию и секрецию. Впоследствии лиганд c-KIT активирует рецептор c-KIT авто- и паракриническим способом. Активация рецептора c-KIT приводит к STAT3 Tyr 705 -фосфорилированию через JAK1 / 2. После STAT3-активации и ядерной транслокации STAT3 связывается с геном TGF-β1-лиганда и регулирует его экспрессию.
Здесь мы демонстрируем существенную роль анализа ChIP для идентификации связывания SMAD2 с промотором лиганда c-KIT-рецептора и для идентификации активатора (и) активатора сигнала (of) транскрипции 3 (связывание STAT3 с TGF-β1- ген).
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом отчете мы демонстрируем индуцированное TGF-β1 связывание SMAD2 с SBE в промоторе лиганда c-KIT и индуцированное TGF-β-связывание STAT3 с его распознающей последовательностью в гене TGF-β1-лиганда. Мы демонстрируем индуцированное цитокином связывание обоих факторов транскрипции с использова?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Университетом Техаса MD Cancer Center в Андерсоне, Хьюстон, штат Техас (стартовые фонды, BB).
Materials
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
Referências
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26 (1), 37-47 (2002).
- Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).
- Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).
- Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94 (5), 585-594 (1998).
- Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).
- Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).
- Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).
