क्रोमैटिन इम्युनोपर्रेबिज़ का उपयोग करने वाली सी-केट लिगेंड प्रमोटर का विश्लेषण
Summary
कई जैविक प्रक्रियाओं के लिए डीएनए प्रोटीन बातचीत आवश्यक होती है। सेलुलर कार्यों के मूल्यांकन के दौरान डीएनए प्रोटीन के विश्लेषण का विश्लेषण जीन विनियमन को समझने के लिए अनिवार्य है। क्रोमेटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चीप) विवो में ऐसे इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।
Abstract
डीएनए प्रतिकृति और मरम्मत, डीएनए पुनर्संयोजन, और जीन अभिव्यक्ति सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं, प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत की आवश्यकता होती है। इसलिए, डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन कई शारीरिक, पथोफिज़ीयोलॉजिकल और जैविक कार्यों को विनियमित करते हैं, जैसे कि सेल भेदभाव, सेल प्रसार, सेल चक्र नियंत्रण, गुणसूत्र स्थिरता, एपीजीनेटिक जीन विनियमन और सेल परिवर्तन। यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, डीएनए हिस्टोन और नॉनहिस्टोन प्रोटीन से संपर्क करता है और इसे क्रोमैटिन में सघन होता है। डीएएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए कई तकनीकी टूल का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि इलैपीओफोरेसिस (जेल) मोबिलिटी शिफ्ट आफ़े (ईएमएसए) और डीएनएस आई फुटप्रिंग। हालांकि, ये तकनीक इन विट्रो में प्रोटीन-डीएनए बातचीत का विश्लेषण करती हैं, सेलुलर संदर्भ में नहीं हैं। क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चीप) एक तकनीक है जो प्रोटीनों को अपने विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी साइटों पर कैप्चर करता है, जिससे डीएनए प्रोटीन बातचीत की पहचान करने की अनुमति मिलती हैउनके क्रोमैटिन संदर्भ में है यह डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन के निर्धारण के द्वारा किया जाता है, इसके बाद ब्याज की प्रोटीन की प्रतिरक्षा प्रवर्तन होता है। इसके बाद, जीनोमिक साइट जो प्रोटीन के लिए बाध्य थी, उसकी विशेषता है। यहाँ, हम चिप का वर्णन करते हैं और चर्चा करते हैं और ट्रान्सफ़ोर्डिंग ग्रोथ फैक्टर-बी बी (टीजीएफ-बी) की पहचान के लिए विश्लेषणात्मक मूल्य का प्रदर्शन करते हैं, प्रतिरूपण कारक एसएएमएडी 2 से एसएमएडी 2 को टायरोसाइन के प्रमोटर क्षेत्र के भीतर SMAD बाध्यकारी तत्वों (एसबीई) प्रोटीन किनेज किट (सी-केआईटी) रिसेप्टर लैगंड स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ)।
Introduction
यूकेरियोट्स के न्यूक्लियस में, डीएनए हिस्टोन प्रोटीन और नॉनहिस्टोन प्रोटीन से संपर्क करता है और इसे क्रोमैटिन में सघन होता है। शारीरिक, रोगप्रतिकारक, और कोशिका जैविक संदर्भ में, सेलुलर फ़ंक्शंस अलग-अलग होते हैं और अस्थायी रूप से क्रोमैटिन-समन्वित जीन अभिव्यक्ति द्वारा नियंत्रित होते हैं। डीएनए प्रतिकृति, पुनर्संयोजन, और मरम्मत, साथ ही साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति जैसे सेलुलर प्रक्रियाओं के विनियमन में डीएनए-प्रोटीन बातचीत की एक महत्वपूर्ण भूमिका है। इसलिए, डीएनए प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति और सेल फ़ंक्शन के मूल्यांकन में एक अनिवार्य उपकरण है।
इन विट्रो में डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए कई तकनीकें होती हैं, जैसे कि इलेक्ट्रोफोरेसिस (जेल) मोबिलिटी शिफ्ट आफ़े (ईएमएसए) और डीएनएस 1 फुटपिंग 1 , 2 । हालांकि, ये तकनीक क्रोमेटिन और सेलुलर संदर्भ में प्रोटीन-डीएनए बातचीत का विश्लेषण नहीं करती हैं। चिप Iएक तकनीक जो प्रोटीन को अपने विशिष्ट डीएनए बाध्य करने वाली साइटों से बन्द करती है और जिससे क्रोमैटिन संदर्भ के भीतर डीएनए प्रोटीन बातचीत की पहचान की सुविधा प्रदान की जाती है। यह तकनीक मूल रूप से एशरचीशिया कोली और ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर 3 , 4 में विशिष्ट जीन के लिए बाध्यकारी आरएनए पोलीमरेज़ II के आकलन के लिए जिमर और लिस द्वारा विकसित की गई थी। यह डीएनए-प्रोटीन परिसरों के निर्धारण के द्वारा किया जाता है, इसके बाद क्रोमैटिन निष्कर्षण प्रदर्शन और डीएनए को ~ 200 बेस जोड़ी (बीपी) के टुकड़ों में कटा हुआ। इसके बाद, डीएनए-ब्याज प्रोटीन की ब्याज immunoprecipitation द्वारा अलग है। डीएनए प्रोटीन क्रॉस्लिंक के उत्क्रमण के बाद, डीएनए शुद्ध और विश्लेषण किया जाता है। प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के विश्लेषण के लिए कई तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है और लक्ष्य जीन 5 के भीतर प्रोटीन बाइंडिंग साइट के न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम पर निर्भर करते हैं। ऐसे मामलों में जहां डीएनए अनुक्रम जाना जाता है, मानक पोलज्ञात बाध्यकारी साइट flanking विशिष्ट प्राइमर जोड़े का उपयोग कर, ymerase चेन प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) लागू किया जा सकता है। मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (qRT-PCR) भी 6 का इस्तेमाल किया जा सकता है जिन मामलों में अनुक्रम अज्ञात है, चिप को डीएनए माइक्रोएरेज़ (चिप-ऑन-चिप), डीएनए अनुक्रमण (चिप-सेक), या क्लोनिंग तकनीक 7 , 8 , 9 के साथ जोड़ा जा सकता है।
टीजीएफ-बीओ मार्ग में शक्तिशाली ट्यूमर को दबाने वाला कार्य है और सेल भेदभाव में एक महत्वपूर्ण मार्ग है। यह TGF-β1 ligand के बंधन के माध्यम से अपने संगत रिसेप्टर परिसर में सक्रिय है, जिसके परिणामस्वरूप एसएडीएडी 2/3 प्रतिलेखन कारकों की सीरीन-फॉस्फोरायलेशन होती है। सामान्य मध्यस्थ, एसएमएडी 4, एसएएमएडी 4 के साथ उनके सहयोग के बाद, नाभिक के लिए ट्रांसकैकेट और लक्ष्य जीन के प्रमोटर क्षेत्र के भीतर एसबीई से बांधता है, जहां यह सेल चक्र, एपप्टोसिस और कोशिका अलग-अलग को नियंत्रित करने वाले जीन को नियंत्रित करता हैपर। टीजीएफ-बीओ उत्तेजना के लिए ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया सेल प्रकार और संदर्भ-विशिष्ट 10 है । हाल ही में, हमने TGF-β और c-KIT मार्ग 11 के बीच एक सकारात्मक प्रतिक्रिया लूप का वर्णन किया है। इस मॉडल में, टीजीएफ-β1- सक्रिय एसएएमएडी 2 सी-केट लिगेंड प्रमोटर को बांधता है और अपनी अभिव्यक्ति और स्राव को प्रेरित करता है। इसके बाद, सी-केट लिगेंड स्वत: और पैरा-क्रिनिक फैशन में सी-केट रिसेप्टर को सक्रिय करता है सीएटी रिसेप्टर सक्रियण परिणाम STAT3 Tyr 705 -phosphorylation JAK1 / 2 के माध्यम से STAT3- सक्रियण और परमाणु हस्तांतरण के बाद, STAT3 टीजीएफ- β1 लीगैंड जीन से बांधता है और इसकी अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है
यहां, हम एसएपीएडी 2 की सी-केआईटी रिसेप्टर लैगेंड प्रमोटर के लिए बाध्यकारी और सिग्नल ट्रांन्सड्यूसर (और) उत्प्रेरक (प्रति) ट्रांसक्रिप्शन 3 (एसटीएटी 3 को टीजीएफ-बी 1-बी -1 के लिए बाध्यकारी) की पहचान के लिए चिप विश्लेषण की अनिवार्य भूमिका को प्रदर्शित करते हैं। जीन)।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में, हम टीजीएफ-β1 लिगैंड जीन के भीतर अपनी मान्यता अनुक्रम के लिए एसएटीए के सी-केट लिगेंड प्रमोटर और टीजीएफ-बी 1-प्रेरित बाध्यकारी के भीतर एसएबीई के टीजीएफ-बी 1-प्रेरित बंधन को प्रदर्शित करते है…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर, ह्यूस्टन, टेक्सास (स्टार्टअप फंड, बीबी) द्वारा समर्थित था।
Materials
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
Referências
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