Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein
Summary
Periphere Injektion von alpha-Synuclein – Fibrillen in das Peritoneum oder die Zunge von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse, der humanen alpha-Synuclein mit der familial A53T – Mutation exprimieren und Glühwürmchen – Luciferase kann Neuropathologie, einschließlich neuroinflammation induziert in ihrem Zentralnervensystem.
Abstract
Um das Prion-ähnliches Verhalten von falsch gefalteten alpha-Synuclein, Mausmodelle zu studieren benötigt werden, mit denen eine schnelle und einfache Übertragung von alpha-Synuclein prionoids, die Neuropathologie im Zentralnervensystem (ZNS) führen. Hier beschreiben wir das intraglossal oder intraperitoneale Injektion von alpha-Synuclein – Fibrillen in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse, die humanen alpha-Synuclein mit der A53T – Mutation aus dem Prionprotein – Promotor überexprimieren und Glühwürmchen – Luciferase aus der Promotor für gliales fibrilläres saures Protein (GFAP), ist ausreichend , um neuropathologische Erkrankung zu induzieren. Im Vergleich zu homozygot Tg (M83 + / +) Mäusen , die Anfang schwere neurologische Symptome im Alter von 8 Monaten, heterozygot Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) entwickeln Tiere bleiben frei von spontaner Krankheit , bis sie ein erreichen Alter von 22 Monaten. Interessanterweise ist die Injektion von alpha-Synuclein-Fibrillen über die intraperitoneMäuse , die mit einer medianen Inkubationszeit von 229 ± 17 Tagen: al Route neurologische Erkrankung mit Paralyse in vier von fünf Tg (GFAP -Luc +/- +/- M83) induziert. Erkrankte Tiere zeigten schwere Ablagerungen von phosphoryliertem alpha-Synuclein in ihrem Gehirn und Rückenmark. Anhäufungen von alpha-Synuclein waren Sarkosyl-unlösliche und mit Ubiquitin und p62 colokalisiert, und wurden durch eine Entzündungsreaktion begleitet, was zu astrozytären Gliose und Mikrogliose. Überraschenderweise Inokulation von alpha-Synuclein-Fibrillen in die Zunge war weniger wirksam bei der Entstehung von Krankheiten mit nur einer der fünf injizierten Tieren alpha-Synuclein Pathologie nach 285 Tagen zeigen. Unsere Ergebnisse zeigen , dass die Impfung über die intraglossal Strecke und um so mehr über die intraperitoneale Route geeignet ist neurologische Erkrankung mit entsprechenden Kennzeichen Synucleinopathien in Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) zu induzieren Mäuse. Dies stellt ein neues Modell für die Untersuchung Prion-ähnliche Pathogenese induziertD durch alpha-Synuclein prionoids näher.
Introduction
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass alpha-Synuclein-Eigenschaften hat, die die des Prion-Protein ähnlich sind, insbesondere in ihrer Fähigkeit zur Selbst Saatgut- und propagiert misfolding zwischen Zellen und Nervenbahnen entlang. Diese Eigenschaft von alpha-Synuclein wird auch als ‚Prion-like‘ oder ‚prionoid‘ genannt, und wird durch Beobachtungen in den Transplantationsexperimenten unterstützt, die die Übertragbarkeit von misfolded alpha-Synuclein von erkrankten Neuronen vorschlagen 1 gesund Neuronen neu transplantierte, 2 , 3, 4. Auch die direkte Injektion von falsch gefalteten alpha-Synuclein in das Gehirn oder den Umfang, beispielsweise die hinteren Gliedmaßen Muskel oder Darmwand, führt zu einer Ausbreitung von alpha-Synuclein Pathologie distale Teile des ZNS , 5, 6, 7, <sup class = "Xref"> 8, 9, 10. Wir analysierten die Übertragung von alpha-Synuclein prionoids über periphere Routen im Detail und mit der Frage, ob misfolded alpha-Synuclein kann das ZNS nach einer einzigen intraglossal oder intraperitoneale Injektion neuroinvade, eine Funktion, die für Prionen hatte zuvor gezeigt worden, nicht aber für falsch gefaltete alpha- Synuclein. Nach der Injektion von Prionen in die Zunge, Neuroinvasion des ZNS ist über Ausbreitung entlang des Hypoglossus der Zunge erreicht , die an den Kern des Hypoglossus führt, die im Hirnstamm 11 befindet. Als Maus – Modell wählten wir Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen, die die A53T Mutante von menschlichem alpha-Synuclein des Prion Promotor überexprimieren und Firefly unter der Kontrolle eines Promotors GFAP Luciferase durch astrozytischen Aktivierung zu überwachen , Biolumineszenz, wie zuvor im Gehirn gezeigt vonPrion-infizierten Mäusen 12. In unseren Händen bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) entwickelten Mäuse bis zum 23. Lebensmonat nicht Krankheit wie von anderen 13 gezeigt. Eine einzige Injektion von humanen alpha-Synuclein – Fibrillen über die intraglossal oder intraperitonealem Weg induzierte neurologische Erkrankung mit Pathologie im Gehirn und Rückenmark von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen die Hypothese stützt , dass alpha-Synuclein prionoids teilen wichtige Eigenschaften mit Prionen 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Periphere Injektion von alpha-Synuclein – Fibrillen in das Peritoneum von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen stellt ein einfaches Verfahren durch Neuroinflammation begleitet neurologische Krankheit zu induzieren wichtige Eigenschaften von Synucleinopathien rekapitulieren. In ähnlicher Weise stellt Zunge Injektion eine andere Route für die Neuroinvasion von alpha-Synuclein prionoids in transgenen Mäusen ist aber weniger effizient. Wir entschieden uns für unsere Experimente bei 420 Tag…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Olga Sharma, Theresa Hundt, und die Mitarbeiter der DZNE-Mikroskopie und Tieranlagen für den technischen Support.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
Referências
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