Bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen Na Perifere Enten van alfa-synucleine fibrillen
Summary
Perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen in het peritoneum of de tong van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen, die humaan alfa-synucleine met familiaire A53T mutatie en vuurvlieg luciferase tot expressie brengen, kunnen neuropathologie induceren, waaronder neuroinflammatie in het centrale zenuwstelsel.
Abstract
De prion-achtige gedrag van verkeerd gevouwen alfa-synucleine bestuderen, zijn muismodellen nodig die snelle en eenvoudige overdracht van alfa-synucleïne prionoids die neuropathologie veroorzaken in het centrale zenuwstelsel (CZS) laten. Hier beschrijven we intraglossal of intraperitoneale injectie van alfa-synucleine fibrillen in bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen, die humaan alfa-synucleine tot overexpressie met A53T mutatie van het prioneiwit promoter en vuurvlieg luciferase van de promotor voor glia fibrillair zuur eiwit (GFAP), volstaat de neuropathologische ziekte induceren. In vergelijking met homozygote Tg (M83 + / +) muizen die ernstige neurologische symptomen beginnen op een leeftijd van 8 maanden, heterozygote Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ontwikkelen dieren vrij blijven van spontane ziekte totdat ze een te bereiken leeftijd van 22 maanden. Interessant injectie van alfa-synucleine fibrillen via intraperitoneal route geïnduceerde neurologische ziekte met verlamming in vier van de vijf Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen met een gemiddelde incubatietijd van 229 ± 17 dagen. Zieke dieren vertoonden ernstige afzettingen van gefosforyleerde alfa-synucleine in hun hersenen en ruggenmerg. Ophopingen van alfa-synucleïne waren Sarkosyl onoplosbare en colocalized met ubiquitine en p62, onder begeleiding van een ontstekingsreactie resulteert in astrocytische gliose en microgliosis. Verrassenderwijs inoculatie van alfa-synucleine fibrillen in de tong minder effectief bij het veroorzaken van ziekte met slechts een van de vijf geïnjecteerde dieren met alpha-synuclein pathologie na 285 dagen. Onze bevindingen tonen aan dat enting via de intraglossal route en nog meer via de intraperitoneale route is geschikt voor neurologische ziekte met relevante kenmerken van synucleïnopathieën induceren in Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen. Dit zorgt voor een nieuw model voor het bestuderen van prion-achtige pathogenese inducerend door alfa-synucleine prionoids nader.
Introduction
Er is groeiend bewijs dat alfa-synucleine heeft kenmerken die lijken op die van het prion eiwit, met name in zijn vermogen om uitzaaien en propageren verkeerd vouwen tussen cellen en langs zenuwbanen. Deze eigenschap van alpha-synuclein wordt ook wel 'prion-achtige' of 'prionoid', en wordt ondersteund door waarnemingen bij transplantatie-experimenten, waarbij de overdraagbaarheid van verkeerd gevouwen alfa-synucleine van aangetaste neuronen suggereren nieuw getransplanteerde gezonde neuronen 1, 2 , 3, 4. Ook directe injectie van verkeerd gevouwen alfa-synucleïne in de hersenen of de periferie, zoals het achterbeen spier of darmwand leidt tot een spreiding van alpha-synuclein pathologie distale delen van het CNS 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. We analyseerden overdracht van alfa-synucleine prionoids via perifere routes nader en de vraag of verkeerd gevouwen alpha-synuclein het CNS kan neuroinvade na één intraglossal of intraperitoneale injectie, een eigenschap die eerder was aangetoond voor prionen maar niet te verkeerd gevouwen alfa- geadresseerd synucleïne. Na injectie van prionen in de tong is neuroinvasion van het CZS bereikt door voortplanting langs de hypoglossale zenuw van de tong tot de kern van de hypoglossuszenuw, die is gelegen in de hersenstam 11. Als muismodel we kozen Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen die de A53T mutant van humaan alfa-synucleine van het prion promoter tot overexpressie brengen en vuurvlieg luciferase onder controle van een GFAP promotor astrocytaire activering door toezicht bioluminescentie, zoals eerder aangetoond in de hersenen vanprion-geïnfecteerde muizen 12. In onze handen bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) heeft muizen niet ontwikkelen van de ziekte tot 23 maanden oud, zoals is aangetoond door anderen 13. Een enkele injectie van humaan alfa-synucleine fibrillen via intraglossal of intraperitoneale route geïnduceerde neurologische ziekte pathologie in de hersenen en ruggenmerg van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen ondersteunt de hypothese dat alfa-synucleine prionoids deel belangrijke kenmerken met prionen 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen in het peritoneum van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen is een gemakkelijke werkwijze voor neurologische ziekte gepaard gaat met inflammatoire processen induceert belangrijke kenmerken van synucleïne interageren recapituleren. Evenzo tong injectie vertegenwoordigt een andere weg voor neuroinvasion door alfa-synucleine prionoids in transgene muizen, maar minder efficiënt. We kozen ervoor om onze experimenten te beëindigen op 420 dagen na d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Olga Sharma, Theresa Hundt, en het personeel van de DZNE microscopie en dierlijke faciliteiten voor technische ondersteuning.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
Referências
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson’s disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson’s disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
