Summary

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Published: May 22, 2017
doi:

Summary

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Abstract

In den letzten zehn Jahren wurden Channelrhodopsine in der neurowissenschaftlichen Forschung unentbehrlich, wo sie als Werkzeuge zur nicht-invasiven Manipulation elektrischer Prozesse in Zielzellen verwendet werden. In diesem Zusammenhang ist die Ionenselektivität eines Kanalrhodopsins von besonderer Bedeutung. Dieser Artikel beschreibt die Untersuchung der Chloridselektivität für ein kürzlich identifiziertes anion-leitendes Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata über elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen auf HEK293-Zellen. Das experimentelle Verfahren zur Messung von lichtgesteuerten Photoströmen erfordert eine schnell umschaltbare – idealerweise monochromatische – Lichtquelle, die in das Mikroskop eines ansonsten konventionellen Patch-Clamp-Setups eingekoppelt ist. Vorbereitende Verfahren vor dem Experiment werden unter Berücksichtigung von gepufferten Lösungen, Überlegungen über Flüssigkeitsübergangspotentiale, Seeding und Transfektion von Zellen und Ziehen von Patchpipetten skizziert. Die tatsächliche Aufzeichnung der Strom-Spannungs-BeziehungS zur Bestimmung der Umkehrpotentiale für verschiedene Chloridkonzentrationen findet nach der Transfektion 24 h bis 48 h statt. Schließlich werden elektrophysiologische Daten in Bezug auf theoretische Überlegungen zur Chloridleitung analysiert.

Introduction

Channelrhodopsine (ChR) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle, die im Augenfleck von beweglichen Grünalgen vorkommen und als primäre Photosensoren für Phototaxis und phobische Reaktionen dienen 1 . Seit ihrer ersten Beschreibung im Jahr 2002 haben die ChRs den Weg für das entstehende Feld der Optogenetik geebnet und können in einer Vielzahl von erregbaren Zellen angewendet werden, z. B. in Skelettmuskeln, im Herzen oder im Gehirn 3 , 4 , 5 . Die Expression von ChRs in Zielzellen führt zu einer lichtsteuerbaren Ionenpermeabilität der jeweiligen Zelle. In einem neuronalen Kontext ermöglicht dies die Aktivierung 6 , 7 , 8 oder die Hemmung 9 , 10 des Aktionspotentials (AP), die – abhängig vom geführten Ion – mit dem räumlichen und zeitlichen abfeuertPräzision des Lichts, die hervorhebt, wie die Ionenselektivität einer ChR-Variante ihre optogenetische Anwendung bestimmt.

Die ersten entdeckten ChRs von Chlamydomonas reinhardtii und Volvox carteri sind für Protonen durchlässig, aber auch für monovalente Kationen wie Natrium, Kalium und in geringerem Maße zu zweiwertigen Kationen wie Calcium und Magnesium 11 , 12 , 13 . Heute sind mehr als 70 natürliche kationenleitende Kanalrhodopsine (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 und mehrere konstruierte Varianten 18 , 19 , 20 mit unterschiedlichen Eigenschaften wie Photostromgröße, spektrale Empfindlichkeit, Kinetik und Kationenselektivität stehen zur Verfügung. Während in der Neurowissenschaften, CCRs aRe verwendet, um Zellen zu aktivieren und APs auszulösen, waren lichtgetriebene mikrobielle Pumpen die einzigen verfügbaren Antagonisten für die Stummschaltung von Neuronen seit Jahren. Im Jahr 2014 zeigten zwei Gruppen gleichzeitig, dass CCRs durch Veränderung der Polarität entlang der putativen Ionen leitenden Pore über molekulare Technik 9 , 21 in anion-leitende Kanalrhodopsine (ACRs) umgewandelt werden können . Anschließend wurden natürliche ACRs in mehreren Kryptophytenalgen 22 , 23 , 24 identifiziert. Am wichtigsten ist, dass die Lichtaktivierung von ACRs Chloridströme in erwachsenen Neuronen vermittelt, was eine Hemmung der neuronalen Aktivität bei viel geringeren Lichtintensitäten ermöglicht als mikrobielle Pumpen, die nur einzelne Ladungen pro absorbiertem Photon transportieren.

Die ChR-Aktivität kann direkt durch elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen von lichtinduzierten Strömen in HEK293-Zellen adressiert werden. Die Patch-ClampTechnik wurde ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt und weiter verbessert von Hamill et al. , Wodurch die Aufzeichnung der Entität von Strömen aus einer kleinen Zelle (Ganzzellenmodus) mit hoher Stromauflösung und direkter Steuerung der Membranspannung 26 ermöglicht wird. In der Zellkultur angewendet, bietet diese Technik eine genaue Kontrolle sowohl der ionischen als auch der elektrischen Aufzeichnungsbedingungen und ermöglicht die Untersuchung der Ionenselektivität zusammen mit dem relativen Beitrag der Ionen zum Gesamtstrom. Hier veranschaulichen wir die Untersuchung der Ionenselektivität für das anion-leitende Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 über die Aufzeichnung von Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen extrazellulären Chlorid-Konzentrationen, um eine hohe Chlorid-Leitfähigkeit zu beweisen.

Protocol

Abbildung 1: Patch-Clamp-Setup. (1) Lichtquelle, (2) optische Faser, (3) programmierbarer Verschluss, (4) Digitalisierer, (5) Blendenautomat, (6) Verstärker, (7) Perfusionssystem, (8) Personal Computer, (9) Monitor (11) Perfusionseinlass, (13) Perfusionsauslass, (14) Aufzeichnungskammer, (15) Flüssigkeitsstandssensor, (16) Badelektrode mit Agarbrücke, (17) Pipettenhalter, (18) Kopfstufe, (19) M…

Representative Results

Fig. 2 zeigt repräsentative Ergebnisse, die aus Messungen nach dem beschriebenen Protokoll erhalten wurden. Bei der Beleuchtung mit grünem Licht weist der Ps ACR1 einen schnellen Übergangsstrom auf, der schnell auf einen stationären Strompegel abfällt. Nach dem Ausschalten des Lichtes zerfallen die Photoströme innerhalb von Millisekunden auf Null (Abbildung 2A ). Der Austausch der extrazellulären Chloridkonzentration bewirkt eine Ve…

Discussion

Die Bestimmung von Umkehrpotentialen bei definierten ionischen und elektrischen Bedingungen liefert Informationen über die nach der Lichtaktivierung von ChRs transportierten Ionenspezies. Wenn nur eine Ionenspezies in einem komplexen physiologischen Medium variiert wird und die erhaltenen Umkehrpotentialverschiebungen nach dem theoretischen Nernstpotential sind, ist diese Ionensorte die einzige transportierte.

Für ChRs sind jedoch Umkehrpotentialverschiebungen in der Regel weniger ausgepr?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Maila Reh, Tharsana Tharmalingam und vor allem Altina Klein für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 bis PH) und dem Exzellenzcluster Vereinigungskonzepte in der Katalyse, UniCat, BIG-NSE (JV) und E4 (PH) unterstützt.

Materials

HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E.coli/ Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E.coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide

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Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).

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