In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren
Summary
Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.
Abstract
Das Nervensystem besteht aus einer enormen Bandbreite von verschiedenen neuronalen Typen zusammen. Diese neuronalen Subpopulationen sind gekennzeichnet durch, unter anderen Merkmalen, ihre unterschiedlichen dendritischen Morphologien, ihre spezifische Muster von axonalen Konnektivität und deren selektive Brennen Antworten. Die molekularen und zellulären Mechanismen, die für diese Aspekte der Differenzierung während der Entwicklung sind immer noch schlecht verstanden.
Hier beschreiben wir kombinierte Protokolle für die Kennzeichnung und die Charakterisierung der strukturellen Verbindungen und Erregbarkeit der Neurone. Die Modifikation der in utero Elektroporation (IUE) Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einer spärlichen Population von Neuronen. Dies wiederum ermöglicht die Identifizierung und Verfolgung der Dendriten und Axone der einzelnen Neuronen, die genaue Charakterisierung der laminaren Lage von axonalen Projektionen und morphometrische Analyse. IUE kann auch in der Erregbarkeit zu untersuchen Veränderungen verwendet werden vonWildtyp (WT) oder gentechnisch veränderten Neuronen indem sie sie mit Ganzzell-Aufnahme von einer akuten Scheiben durch Elektroporation Gehirne zu kombinieren. Diese beiden Techniken tragen zu einem besseren Verständnis der Kopplung von strukturellen und funktionalen Verbindungen und der molekularen Mechanismen der neuronalen Steuerung Vielfalt während der Entwicklung. Diese Entwicklungsprozesse haben wichtige Auswirkungen auf axonalen Verkabelung, die funktionelle Diversität von Neuronen und die Biologie von kognitiven Störungen.
Introduction
Die Entwicklung von dendritischen und axonalen Strukturen ist ein wichtiger Aspekt der Schaltungsregelung im Nervensystem, in der Großhirnrinde einschließlich. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der selektiven Verdrahtung der verschiedenen neuronalen Subpopulationen. Eine Anzahl von jüngsten Berichte haben gezeigt, dass, zusätzlich zu Verbindungen, die molekulare Vielfalt von Neuronen wird durch die Übernahme von hochspezifischen Modi des Brennens reflektiert. Die Mechanismen , die Erregbarkeit und Konnektivität der verschiedenen neuronalen Subtypen während der Entwicklung, sowie ihre Koordinationsgrad zu bestimmen, sind jedoch immer noch schlecht verstanden , 1, 2.
In vivo Verlust- und gain-of-function Analysen zur Untersuchung der Beziehung zwischen der Expression von spezifischen Genen und deren Einfluss auf die Entwicklung der Schaltung ermöglichen. In utero Elektroporation (IUE) ist eine Technik weit verbreitet zu studierendie Funktion eines Gens von Interesse in spezifischen neuronalen Populationen und die Gesamtmuster ihrer Verbindungen zu studieren. Um jedoch die morphologischen Eigenschaften von Axonen und Dendriten in kortikalen Schichten in lebenden Mäusen zu bestimmen, ist es wichtig, Neuronen dünn zu beschriften. Eine Cre-Rekombinationssystem mit IUE kombiniert verwendet werden, um ein Sparse-Population von Neuronen bei einer ausreichend niedrigen Dichte zu markieren die Vorsprünge durch einzelne Zellen der identifizierten kortikalen laminas emittiert zu lösen. Diese Methode Etiketten eine ausreichende Anzahl von Neuronen pro Kortex quantitative Daten nach der Analyse der angemessenen Anzahl von elektroporiert Gehirne (Abbildung 1) zu erhalten. Dieses Manuskript stellt eine Methode für eine solche Feinanalyse der Konnektivität. Es stellt auch eine ähnliche Strategie zu analysieren, in getrennten Experimenten, die elektrischen Eigenschaften von Neuronen, die durch Strom-Clamp-Aufnahmen auf grün fluoreszierendes Protein Durchführung (GFP) -electroporated Zellen aus akuten kortikalen Scheiben schneiden. Diese proTocole sind vielseitig und können zur Untersuchung der Erregbarkeit und Konnektivität von Neuronen durch zusätzliche Plasmide während IUE WT und transgenen Tieren und auch von Neuronen in denen Verluste und Gewinne von Funktions eingeführt angewendet werden.
Obwohl dieses Protokoll kann die Elektroporation von Mäusen an embryonalen Tag (E) 15.5, diese Technik durchgeführt zwischen E9.5 3 und postnatalen Tag (P) 2 4 in jedem Alter werden beschrieben. Während der Elektroporation in frühen Stadien zielt Neuronen und Vorstufen des Thalamus und tiefen Schichten der Hirnrinde, späteren Stufe der Elektroporation Markierungen oberflächlicher Schichten (zB E15.5 IUE Ziele Schicht II-III Neuronen). Zusammenfassend ist die Kombination von IUE mit Einzelzell morphologische Analyse und die Elektro ein nützliches Werkzeug, um die molekularen Mechanismen, die die enorme strukturelle und funktionelle Vielfalt von Neuronen im Nervensystem zu erläutern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie Neuronen des somatosensorischen Kortex von C75BL / 6-Mäuse zu beschriften, um ihre Verbindungen und ihre Erregbarkeit zu analysieren. In Bezug auf die bestehenden Methoden, visualisiert sie diskriminierende Aspekte der Konnektivität, wie die Anzahl der axonalen Verzweigungen pro Neuron, ihre genaue Topographie und ihrer anatomischen Lage. Durch Veränderung der Position der Elektroden, ist es möglich , andere Neuronenpopulationen, wie beispielsweise die cingulären Cortex zu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken R. Gutiérrez und A. Morales für ihre hervorragende technische Unterstützung und LA Weiss für die Bearbeitung. CGB wird von der spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011 finanziert. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von BBVA-Stiftung und SAF2014-58598-jin (Mineco) M. Navarrete und durch einen Zuschuss aus dem Ramón Areces Stiftung und Zuschüsse SAF2014-52119-R und BFU2014-55738-REDT finanziert (von Mineco) zu M. Nieto.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
Referências
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