Usando um TMEM184A GFP Construir para a confirmação da Heparina Receptor Identity
Summary
Uma construção que codifica TMEM184A com uma marcação GFP no carboxi-terminal concebido para expressão eucariótica, foi empregue em ensaios desenhados para confirmar a identificação de um receptor TMEM184A como heparina em células vasculares.
Abstract
Quando novas proteínas são identificados através de análise de isolamento e bioinformática à base de afinidade, eles são muitas vezes não caracterizados em grande parte. Os anticorpos contra os péptidos específicos dentro da sequência prevista permitir que algumas experiências de localização. No entanto, outros possíveis interacções com os anticorpos muitas vezes não podem ser excluídos. Esta situação constituiu uma oportunidade para desenvolver um conjunto de ensaios dependentes da sequência da proteína. Especificamente, foi obtida uma construção contendo a sequência de gene acoplado à sequência codificante de GFP na extremidade C-terminal da proteína e utilizados para estes fins. Experimentos para caracterizar localização, afinidade do ligando, e ganho de função foram originalmente concebidos e realizados para confirmar a identificação de TMEM184A como um receptor heparina 1. Além disso, a construção pode ser utilizada para estudos abordando questões de topologia de membrana e as interacções proteína-ligando detalhados. O presente relatório apresenta arange de protocolos experimentais com base na GFP-TMEM184A expresso em células vasculares que poderia ser facilmente adaptada para outras novas proteínas.
Introduction
Identificação de proteínas candidatas para novos funções muitas vezes depende protocolos de isolamento à base de afinidade, seguido por determinação da sequência parcial. Exemplos recentes de proteínas recentemente identificados incluem proteína transmembranar 184A (TMEM184A), um receptor de heparina identificado após interacções de afinidade de heparina 1, e TgPH1, um proteína do domínio de homologia que se liga plecstrina PI fosfoinositida (3,5) P 2 2. Outro novo identificação de proteínas envolve a análise de sequência directa de péptidos, tais como que por Vit, et ai. que usou peptídeos transmembrana para identificar produtos de proteínas de genes previamente descaracterizados 3. Do mesmo modo, a identificação de sequências de proteína nova pode ser realizada utilizando bioinformática procura de famílias de proteínas previamente caracterizadas como a identificação de novas proteínas 4TM 4. Exame de sequências de genes da família aquaporin tem alpor isso permitiu a identificação de novos membros com novas funções 5. Após a identificação, análise da função da proteína é tipicamente um passo seguinte, que pode, por vezes, ser examinada utilizando um ensaio específico da função da proteína, tais como no caso aquaporina.
Quando possível, a função de uma proteína recentemente identificada pode ser examinada com enzimática específica ou ensaios in vitro de função semelhante. Porque muitas funções de novas proteínas dependem de interacções complexas que ocorrem apenas em células intactas ou organismos, em ensaios in vitro não são sempre eficazes. No entanto, os ensaios in vivo devem ser concebidos de tal maneira que eles dependem da sequência do gene. Em cultura de células, e / ou organismos modelo simples, knockdown pode fornecer elementos de prova para a identificação / função da proteína 6. Com novas proteínas identificadas como notado acima, é muitas vezes insuficiente para derrubar simplesmente uma proteína para confirmar a função, umad o desenho de ensaios funcionais in vivo que dependem da sequência do gene torna-se importante para a caracterização de novas proteínas.
A recente identificação de TMEM184A como um receptor de heparina (que modula a proliferação no músculo liso vascular e respostas inflamatórias em células endoteliais), utilizando cromatografia de afinidade e de MALDI MS 1, 7 fornecido uma oportunidade para desenvolver um conjunto de ensaios após knockdown produziu resultados consistentes com a identificação . Uma revisão recente confirmou que a heparina interage especificamente com muitos factores de crescimento, os seus receptores, os componentes da matriz extracelular, adesão celular, receptores e outras proteínas 8. No sistema vascular, a heparina e os proteoglicanos de sulfato de heparano (contendo cadeias de sulfato de heparano de uma estrutura semelhante à heparina) interagem com várias centenas de proteínas 9. Para confirmar funcionalmente that TMEM184A estava envolvido com a captação de heparina e de ligação, as técnicas que empregaram a construção de gene para TMEM184A foram desenvolvidos. O presente relatório inclui um conjunto de ensaios com base em um GFP-TMEM184A construção para utilização em confirmando a identidade do TMEM184A como um receptor de heparina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos aqui relatados foram concebidos para proporcionar provas de confirmação para a identificação de um receptor TMEM184A como heparina em células vasculares 1. knockdown técnicas são rotineiramente utilizado como um mecanismo para confirmar a identificação de novas proteínas. No entanto, alguma perda funcional após knockdown não é geralmente suficiente a prova de que uma proteína candidata é realmente o receptor correcto (ou outra proteína funcional). É também importan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
Referências
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