באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות
Summary
TMEM184A קידוד לבנות עם תג ה- GFP על הסופית- carboxy המיועד ביטוי איקריוטיים, הועסק מבחנים שנועדו לאשר את זיהוי של TMEM184A כמו קולטן הפרין בתאי כלי דם.
Abstract
כאשר חלבונים חדשים מזוהים באמצעות ניתוח בידוד ביואינפורמטיקה מבוסס זיקה, הם לעתים קרובות uncharacterized ברובו. נוגדנים נגד פפטידים ספציפיים בתוך רצף החזה לאפשר כמה ניסויי לוקליזציה. עם זאת, אינטראקציות אפשריות אחרות עם הנוגדנים לעתים קרובות לא ניתן לשלול. מצב זה ספק הזדמנות לפתח סדרה של מבחנים תלויים רצף החלבון. באופן ספציפי, מבנה המכיל את רצף הגן מצמידים את רצף קידוד GFP בסוף C- מסוף של החלבון הושג והעסיק למטרות אלה. ניסויים לאפיין לוקליזציה, זיקה ליגנד, ורווח של פונקציה תוכננו במקור ובוצע כדי לאשר את הזיהוי של TMEM184A כמו קולטן הפרין 1. בנוסף, המבנה יכול להיות מועסק ללימודים בשאלות טופולוגיה הממברנה אינטראקציות חלבון-ליגנד מפורטים. הדו"ח הנוכחי מציג arange של פרוטוקולי ניסוי מבוססים על מבנה GFP-TMEM184A לידי ביטוי בתאי כלי דם שיכול בקלות להיות מותאם עבור חלבונים חדשים אחרים.
Introduction
זיהוי של חלבוני מועמד פונקציות רומן לעתים קרובות תלוי פרוטוקולי בידוד מבוסס זיקה ואחריו נחישות רצף חלקית. הדוגמות אחרונות של חלבונים זיהו לאחרונה כוללות הטרנסממברני חלבון 184A (TMEM184A), קולטן הפרין המזוהה לאחר אינטראקציות זיקת הפרין 1, ו TgPH1, חלבון מושלם הומולוגית pleckstrin שקושר PI phosphoinositide (3,5) P 2 2. זיהוי חלבונים הרומן השני כרוך ניתוח רצף ישיר של פפטידים כגון שעד Vit, et al. שהשתמשו פפטידים הטרנסממברני לזהות מוצרי חלבון מן הגנים uncharacterized בעבר 3. באופן דומה, זיהוי רצפי חלבוני רומן ניתן להשיג באמצעות ביואינפורמטיקה מחפש משפחות חלבון מאופיינים בעבר כגון זיהוי של חלבוני 4TM חדשים 4. בחינת רצפי גנים המשפחה aquaporin יש אלכך הניב זיהוי של חברים חדשים עם פונקציות רומן 5. לאחר זיהוי, ניתוח של תפקוד חלבון הוא בדרך כלל השלב הבא שלפעמים ניתן לבדוק באמצעות assay ספציפי של תפקוד חלבון כגון במקרה aquaporin.
במידת האפשר, פונקציה של חלבון זיהו לאחרונה ניתן לבדוק עם האנזימטית ספציפי או מבחני תפקוד חוץ גופית דומה. בגלל פונקציות רבות של חלבונים חדשים תלויות יחסי גומלין מורכבים המתרחשים רק פגעו תאים או אורגניזמים, ב מבחני חוץ גופייה לא תמיד יעילים. עם זאת, מבחני vivo ב חייב להיות מתוכנן בצורה כזאת, כי הם תלויים רצף הגן. תרבית תאים, ו / או אורגניזמים מודל פשוט, מציאה יכולה לספק ראיות תומכות לזיהוי חלבון / הפונקציה 6. עם חלבונים חדשים שזוהו כאמור לעיל, הוא לעתים קרובות די פשוט להפיל חלבון כדי לאשר פונקציה, גידולד העיצוב של in vivo מבחנים תפקודיים שתלויים רצף גן הופך להיות חשוב עבור האפיון של חלבונים חדשים.
הזיהוי האחרונה של TMEM184A כמו קולטן הפרין (כי מודולציה התפשטות שריר חלק בכלי דם ותגובות דלקתיות בתאי האנדותל) באמצעות כרומטוגרפיה זיקת MALDI MS 1, 7 ספקו הזדמנות לפתח אוסף של מבחנים לאחר מציאת ניב תוצאות עקביות עם זיהוי . סקירה אחרונה אשרה כי הפרין אינטראקציה במיוחד עם גורמי גדילה רבים, הקולטנים שלהם, רכיבים תאים מטריקס, קולטנים הידבקות תא, וחלבונים אחרים 8. במערכת כלי הדם, הפרין ו proteoglycans סולפט heparan (המכיל שרשראות סולפט heparan הדומים במבנה שלהם הפרין) אינטראקציה עם כמה מאות חלבונים 9. כדי לאשר מבחינה תפקודית that TMEM184A היה מעורב עם ספיגת הפרין ומחייבת, טכניקות שהעסיקו את מבנה הגן TMEM184A פותחו. הדו"ח הנוכחי כולל אוסף של מבחנים המבוססים על ה- GFP-TMEM184A לבנות לשימוש המאשר את זהותו של TMEM184A כמו קולטן הפרין.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים דיווחו כאן נועדו לספק עדויות מאשרות לזיהוי TMEM184A כמו קולטן הפרין בתאי כלי הדם 1. טכניקות מציאה משמשים באופן שגרתי כמנגנון אחד כדי לאשר את הזיהוי של חלבונים חדשים. עם זאת, כמה אובדן תפקודי לאחר המציאה היא בדרך כלל לא הוכחה מספקת כי חלבון מועמד ה?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
Referências
- Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
- Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
- Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
- Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
- Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
- Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
- Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
- Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
- Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
- Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
- Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, 461-469 (1995).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
- Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
- Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
- Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
- Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
- Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
- Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).
