ein GFP-markierten TMEM184A Verwendung für die Bestätigung der Heparin-Rezeptor Identität Construct
Summary
Ein Konstrukt Codierung TMEM184A mit einem GFP-Tag am Carboxy-Terminus für eukaryotische Expressions entworfen wurde in Assays entwickelt, um zu bestätigen die Identifizierung von TMEM184A als Heparin-Rezeptor in vaskulären Zellen eingesetzt.
Abstract
Wenn neue Proteine identifiziert werden durch Affinitäts-basierte Isolierung und Bioinformatik-Analyse, sind sie oft weitgehend uncharacterized. Antikörper, die gegen spezifische Peptide innerhalb der vorhergesagten Sequenz einige Lokalisierungs Experimente erlauben. Jedoch können auch andere mögliche Wechselwirkungen mit den Antikörpern oft nicht ausgeschlossen werden kann. Diese Situation bot die Möglichkeit, eine Reihe von Tests, abhängig von der Proteinsequenz zu entwickeln. Insbesondere ist ein Konstrukt, das das Gen-Sequenz am C-terminalen Ende des Proteins an das GFP-codierende Sequenz gekoppelt enthielt, wurde für diese Zwecke gewonnen und eingesetzt. Experimente Lokalisierung, Ligandenaffinität zu charakterisieren, und die Verstärkung der Funktion wurden ursprünglich entworfen und ausgeführt , um die Identifizierung von TMEM184A als Heparin – Rezeptor 1 bis bestätigen. Zusätzlich kann das Konstrukt für Studien Adressieren Membrantopologie Fragen und detaillierter Protein-Ligand-Wechselwirkungen eingesetzt werden. Der vorliegende Bericht stellt arange der experimentellen Protokolle auf der Basis der GFP-Konstrukt TMEM184A in vaskulären Zellen exprimiert, die leicht für andere neue Proteine angepasst werden könnte.
Introduction
Identifizierung von Kandidatenproteine für neuartige Funktionen hängt oft von Affinität basierende Isolation Protokolle durch partielle Sequenzbestimmung gefolgt. Jüngste Beispiele für neu identifizierten Proteine sind Transmembranprotein 184A (TMEM184A), eine Heparin – Rezeptor identifiziert nach Heparin – Affinität Wechselwirkungen 1 und TgPH1, eine pleckstrin Homologie – Domäne – Protein , das Phosphoinositid PI (3,5) P 2 2 bindet. Andere neuartige Proteinidentifikation beinhaltet direkte Sequenzanalyse von Peptiden , wie sie von Vit, et al. die verwendeten Trans Peptide Proteinprodukte von bisher nicht charakterisierte Gene 3 zu erkennen. In ähnlicher Weise kann die Identifizierung neuer Proteinsequenzen erreicht werden Bioinformatik unter Verwendung von zuvor charakterisierten Proteinfamilien suchen, wie Identifizierung neuer 4TM Proteine 4. Die Prüfung der Aquaporinfamilie Gensequenzen hat also ergab die Identifizierung neuer Mitglieder mit neuen Funktionen 5. Nach der Identifizierung, Analyse der Proteinfunktion ist typischerweise ein nächster Schritt, die manchmal einen spezifischen Assay von Protein-Funktion, wie beispielsweise in dem Aquaporin Fall untersucht werden können.
Wenn möglich, die Funktion eines neu identifizierte Protein kann mit spezifischen enzymatischen oder ähnlichen in vitro – Assays Funktion untersucht werden. Da viele Funktionen der neuen Proteine in komplexen Wechselwirkungen abhängen , die nur in intakten Zellen oder Organismen auftreten, de – vitro – Tests sind nicht immer wirksam. Jedoch müssen die de – vivo – Tests in der Weise ausgebildet sein , dass sie auf der Gensequenz abhängen. In Zellkultur und / oder einfachen Modellorganismen, kann Knockdown Nachweise für sorgen für die Protein / Funktion Identifizierung 6. Mit neuartigen Proteine identifiziert, wie oben erwähnt, ist es oft nicht einfach ein Protein abreißen zu Funktion bestätigen, eind die Gestaltung der in vivo funktionelle Assays , die auf Gensequenz abhängen wird zur Charakterisierung von neuen Proteinen wichtig.
Die kürzliche Identifizierung von TMEM184A als Heparin – Rezeptor (die Proliferation in der glatten Gefäßmuskulatur und Entzündungsreaktionen in Endothelzellen moduliert) unter Verwendung von Affinitätschromatographie und MALDI – MS – 1, 7 versehen , die Möglichkeit , eine Sammlung von Assays zu entwickeln , nach dem Zuschlags Ergebnisse erzielt , die mit der Identifizierung . Eine aktuelle Überprüfung bestätigt , dass Heparin spezifisch mit vielen Wachstumsfaktoren in Wechselwirkung tritt, ihre Rezeptoren, extrazellulären Matrixkomponenten, Zelladhäsion Rezeptoren und anderen Proteinen 8. Im Gefäßsystem, Heparin und Heparansulfat – Proteoglykane (enthaltend Heparansulfatketten ähnlich in Struktur zu Heparin) interagieren mit mehreren hundert Proteine 9. Um funktionell bestätigen that TMEM184A wurde mit Heparin-Aufnahme beteiligt und Bindung, Techniken, die das Genkonstrukt für TMEM184A eingesetzt wurden entwickelt. Der vorliegende Bericht enthält eine Sammlung von Assays auf Basis eines GFP-TMEM184A zur Verwendung konstruieren in die Identität von TMEM184A als Heparin-Rezeptor bestätigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Protokolle , die hier berichtet wurden entwickelt 1 bestätigenden Beweis für die Identifizierung von TMEM184A als Heparin – Rezeptor in vaskulären Zellen. Knockdown Techniken werden als ein Mechanismus zur Bestätigung der Identifizierung neuer Proteine routinemäßig eingesetzt. Allerdings ist einige Funktionsverlust nach Zuschlags typischerweise nicht ausreichenden Nachweis, dass ein Kandidat Protein ist eigentlich die richtige Rezeptor (oder andere funktionelle Protein). Es ist au…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
Referências
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